杨郑州，李 曦，谢晓娜*
（1.百色学院 农业与食品工程学院，广西 百色 533000；
2.广西芒果生物学重点实验室，广西 百色 533000；
3.亚热带特色农业产业学院，广西 百色 533000）
芒果被誉为“热带水果之王”，主要种植于热带、亚热带地区［1］，是当地农民经济收入的主要来源［2］，是我国东南沿海地区重要的特色农产品之一。芒果的果皮作为芒果加工过程中的副产物，占鲜果重的9%～16%［3］，主要的处理方式是丢弃或焚烧［4］。有研究表明：芒果皮中富含丰富的膳食纤维、果胶以及多酚类物质［5］，芒果皮经二次加工提取的有效成分可作为添加剂或抗氧化剂，应用于食品工业。二次加工芒果皮不仅可以将芒果皮变废为宝，还能创造经济价值、减少环境污染和资源浪费。
在食品加工过程中，多酚氧化酶(PPO)引起的酶促褐变会使得果蔬的颜色、味道、营养受到破坏，通常会添加化学合成的抗氧化剂，如丁基羟基茴香醚(BHA)来防止果蔬褐变。但这类化学合成的抗氧化剂可能存在潜在的毒性和致癌性而影响人们的身体健康，因此需要从植物中提取天然的酚类抗氧化成分。芒果皮中的多酚具有抗氧化、抑菌等多种功能［6-9］，还可清除人体内的自由基，使人体的自由基含量处在一个比较稳定适宜的状态［10］。本研究采用超声波+乙醇浸提法提取芒果皮中的多酚，通过单因素试验和正交试验优化芒果皮多酚的提取工艺，并在最佳提取工艺条件下比较不同品种芒果皮多酚含量的变化，测定其抗氧化能力，以期为芒果皮多酚的开发与利用提供参考。
1.1 试验材料
从广西百色市塘兴村分别采摘台农、贵妃、金煌芒等品种生长良好且适时成熟的果实。
芒果皮预处理：样果采摘后尽快带回实验室，先用流水冲洗果皮的灰尘、杂质，然后切开芒果，去除果肉、果核，再用清水清洗果皮上残留的粗纤维和果肉；
果皮晾晒至无明显水滴后放于干燥箱中，在60 ℃下干燥8 h，然后用小型粉碎机打磨成粉，过40目筛得到最终样品，样品使用保鲜袋包扎好并标明日期，置于阴凉处保存。
1.2 试验方法
1.2.1 多酚的提取 准确称量2 g干燥、纯净的没食子酸标准品，溶于蒸馏水中，待溶解完全后转移至20 mL容量瓶中，定容后备用。用移液枪分别准确吸取0、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL的100 μg/mL没食子酸标准溶液，转移至8个洁净的10.00 mL的容量瓶中。每个容量瓶都分别添加0.50 mL福林酚试剂和1.00 mL饱和碳酸钠溶液，再加入蒸馏水定容。以浓度为0 μg/mL的标准溶液作为参照，采用紫外可见光分光度计测定各个浓度溶液在760 nm处的吸光度，以没食子酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，得到标准曲线方差：y=0.0620x+0.0760，R2=0.9902。
准确称量芒果皮粉末1 g放于洁净烧杯中，加入适量的乙醇，将上述混合液在超声波中振荡，根据试验方案，设置不同的提取时间和提取温度；
超声波振荡结束后转移至50.00 mL离心管中进行离心，3000 r/min下离心10 min，重复2次离心后将上清液缓慢倒入规格为25.00 mL的容量瓶中，转移过程为避免沉淀进入容量瓶，使用玻璃棒进行引流；
最后用体积分数为50%的乙醇溶液定容，得到待测溶液。
1.2.2 多酚含量的测定 准确称量各个试验因素的待测溶液1.00 mL于5个洁净的10.0 mL容量瓶中，各容量瓶分别加入1.00 mL饱和Na2CO3溶液和0.50 mL福林酚溶液，定容，慢慢摇晃瓶身30 s，以确保各组分充分溶解，得到待测液。配置一管加入1.00 mL饱和Na2CO3溶液和0.50 mL福林酚试剂的对照液，定容，摇匀。用紫外光分光度计测定待测液760 nm处的吸光值，重复3次，结果取平均值，多酚含量（以没食子酸的相当值表示）的计算公式：待测溶液多酚含量(mg/g)=方程中求得的多酚含量(μg/mL)×样品稀释倍数(75)/1000。
1.3 单因素试验
本试验采用单因素试验和控制变量法分析台农芒果皮多酚的最佳提取工艺。固定乙醇浓度40%、提取时间30 min、料液比1∶20 g/mL、提取温度30 ℃，分析不同乙醇浓度（20%、30%、40%、50%、60%)、不同提取时间（10、20、30、40、50 min)、不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)、不同提取温度（10、20、30、40、50 ℃）对芒果皮多酚提取率的影响。各个因素试验重复3次，结果取平均值。
1.4 正交试验
在单因素试验的基础上，采用L9（34）正交试验考察4个因素对芒果皮多酚提取率的影响，试验重复3次。正交试验因素设计见表1。
表1 正交试验因素与水平
1.5 抗氧化能力的测定
采用水杨酸法测定多酚对羟自由基（·OH）的清除率，采用1,1二苯基-2-苦肼基法测定对DPPH自由基的清除率。
1.6 数据统计与分析
所有试验结果均表示为平均值±标准偏差。应用SPSS 11.5软件对数据进行方差分析，利用Duncan’s多重比较法进行差异显著性分析。
2.1 乙醇浓度对多酚提取率的影响
由图1可知，在一定浓度范围内，芒果皮多酚的提取率随着乙醇浓度的升高而提高，且变化幅度较大（0.23%～0.39%），这说明乙醇体积分数对提取率的影响很明显；
在乙醇浓度为40%时，芒果皮多酚的提取率达到最大值，为0.39%。此后，随着乙醇浓度的提高，多酚提取率不断下降，且下降幅度较大，最低值也低于先前水平，这表明过高的乙醇浓度会导致有机质的溶解，多酚类化合物与杂质都溶于其中，两者竞争溶剂，导致提取难度加大，使得试验结果的误差也显著增大。
图1 乙醇浓度对提取率的影响
2.2 提取时间对多酚提取率的影响
由图2可知，在提取时间10～30 min范围内，芒果皮多酚的提取率呈现出上升的趋势，提取时间为30 min时达到最大，为0.34%；
提取时间超过30 min后，多酚提取率先下降然后保持稳定，这可能是因为提取时间越长，乙醇的挥发也越明显，对提取环境的影响也越大，此外，试验杂质也会大量融入提取剂，多酚类物质的稳定性也会随着提取时间的延长而发生改变。
图2 提取时间对提取率的影响
2.3 料液比对多酚提取率的影响
由图3可知，在料液比为1∶10～1∶50条件下，芒果皮多酚的提取率呈现先升高后降低的趋势，高的料液比为多酚化合物提供一个良好的提取环境，提取效率与速率都明显增加；
当料液比为1∶20时达到最大值，为0.33%；
料液比超过1∶20时，多酚提取率不断下降并稳定在0.16%左右，这可能是样品中的大部分多酚已被提取并趋于饱和所致。
图3 料液比对提取率的影响
2.4 提取温度对多酚提取率的影响
由图4可知，在10～30 ℃范围内，芒果皮多酚的提取率随着温度的升高而上升，该过程整个反应体系的活化能并没有发生改变，但温度的升高使得反应物的运动速度加快，使得样品与乙醇的接触面积增大，从而加快了提取的效率；
当温度为30 ℃时，多酚的提取率达到了最大值（0.33%）；
当温度超过30 ℃时，提取率开始逐渐下降，可能是提取温度已经超过了多酚的最大承受能力，其生理活性遭到一定的破坏，转变后的产物进而恶化了整个提取环境，高温也使大量杂质进入溶解物，并影响了提取物的纯度。
图4 温度对芒果皮多酚提取率的影响
2.5 正交试验结果与方差分析
由表2可知，影响芒果皮多酚提取的因素排序为：A＞C＞D＞B，即乙醇浓度＞料液比＞提取温度＞提取时间，最佳的因素水平组合为A3B2C1D3，即提取芒果皮多酚的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度50%、提取时间30 min、料液比1∶10、提取温度40 ℃，在此条件下的芒果皮多酚的提取率为0.752%。
表2 正交试验结果分析
由表3可知，乙醇浓度和料液比对芒果皮多酚提取率的影响均达到了显著水平，而提取温度和提取时间对提取率的影响显著，说明乙醇浓度和料液比对芒果皮多酚提取率的影响较大，而提取温度和提取时间对芒果皮多酚提取率的影响相对较小，这与正交试验的结果一致。因此，采用乙醇法提取芒果皮多酚时，需要严格控制乙醇浓度和料液比。
表3 正交试验结果的单变量方差分析
2.6 样品中多酚的含量
由图5可知，3个芒果品种中果皮多酚的含量以台农的含量最高，为11.518 mg/g，贵妃的含量最低，为10.410 mg/g。3个芒果品种果皮多酚含量大小依次为：台农＞金煌芒＞贵妃。
图5 不同品种芒果果皮中的多酚含量对比
2.7 多酚对羟自由基的清除能力
由图6可知，芒果皮多酚对羟自由基的清除效果与其浓度呈正相关，多酚浓度越高对羟自由基的清除率也越高，其中台农芒果皮提取的多酚对羟自由基的清除率最高，金煌芒的次之，贵妃的最低；
从3个品种的芒果皮中提取的多酚随着多酚浓度的升高，其对羟自由基清除率均有一个较大的增幅，但VC浓度的升高对羟自由基的清除率的变化较小，呈现出缓慢升高的趋势；
在相同浓度水平，芒果皮多酚对羟自由基的清除率比VC溶液的清除率更高。
图6 芒果皮多酚及VC对羟自由基的清除率
2.8 多酚对DPPH自由基的清除
由图7可知，3个品种芒果皮中提取的多酚及VC对DPPH的清除能力均会随着浓度的增大而增强，在40 μg/mL浓度水平，VC对DPPH的清除率低于3个品种芒果皮多酚的；
从台农芒果皮提取的多酚对DPPH自由基的清除率始终高于金煌芒的，从贵妃芒果皮提取的多酚对DPPH自由基的清除率低于台农、金煌芒。
图7 芒果皮多酚及VC对DPPH自由基的清除率
多酚是一类多元酚化合物，包括黄酮类、酚酸类和不常见的二苯乙烯、木质素等［11］。多酚又称单宁，是植物体内最重要的酚类次生代谢产物，广泛分布于各种水果、蔬菜、谷物中［12］。植物多酚具有独特的化学和生理活性，如还原性与金属离子络合以及诸多衍生化反应的活性等［13］，因此植物多酚在医药、生态环境、食品等领域具有广泛的应用。植物多酚的药理作用主要包括抑菌、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、降血糖、降血脂、增加人体免疫力、降低尿毒素及抗动脉粥样硬化等作用［14］。在正常情况下，人体内自由基的产生和清除是平衡的，不会危害人体健康，但是产生过多的自由基或抗氧化体系出现故障，人体的自由基代谢就会出现失衡，从而导致膜质过氧化和细胞损伤，并引起人体衰老和心脏病、动脉粥样硬化、癌症、炎症糖尿病等严重疾病［15-16］。植物体提取多酚类物质的过程非常依赖溶剂，通过增加所用溶剂的极性，可提高植物多酚类物质的提取率［17］。DPPH自由基被广泛用于评价各种天然产物自由基的清除能力，被认为是脂质自由基的模型化合物［18］。许多研究表明，一些慢性疾病，如癌症和心血管疾病等，都是由脂质过氧化过程产生的自由基导致的［19］。
本文通过乙醇法提取芒果皮多酚，试验结果表明芒果皮多酚的提取物具有较强的还原能力，对羟自由基和DPPH自由基都有较强的清除能力，且清除效果要优于VC，这说明从芒果皮提取的多酚是一种优良的自由基清除剂，具有很好的保健作用，本试验结果与刘杰超等［20］的研究结果一致。王存堂等［21］以甲醇、乙醇、丙酮作为溶剂提取黄色洋葱皮的总酚，发现提取物对DPPH自由基和ABTS自由基都具有较好的清除作用，且甲醇提取总酚的清除率最高。杨冰鑫等［22］研究发现余甘子多酚对DPPH自由基和羟基自由基都具有较高的清除率，且均显著高于茶多酚，余甘子多酚具有较好的抗氧化活性。康超等［23］以6个品种的芒果核为原料提取其中的多酚和黄酮，提取物对羟基自由基、超氧阴离子自由基清除率都较强。李琳等［24］对芒果皮提取物的抗氧化活性做了相关的研究，发现芒果皮粗提取液的抗氧化活性大于VC的，且浓度越高其抗氧化能力越强。文良娟等［25］以4个品种的芒果叶为原料，采用乙醇热回流法提取芒果叶中的黄酮与多酚类物质，结果显示两者对羟自由基和DPPH自由基都有较强的清除作用，其中金煌芒的清除效果最好，并且要远远高于VC的。贾桂云等［26］采用福林酚试剂法测定70%乙醇溶液的芒果和番石榴提取物中的多酚含量，提取物多酚含量大小顺序为芒果皮＞番石榴皮＞ 番石榴肉＞芒果肉，果皮的抗氧化能力高于果肉，且抗氧化能力与多酚含量呈正相关。
本研究对料液比、提取温度、提取时间、乙醇浓度4个试验因素进行了多个不同水平梯度的探究，结果表明：上述4个因素对芒果皮多酚的提取率都有影响，其中影响最大的是乙醇浓度，最小的是提取时间。通过正交试验确定芒果皮多酚提取的最佳工艺为：乙醇浓度50%、提取时间30 min、料液比1∶10、提取温度40 ℃，在此条件下的芒果皮多酚提取率为0.752%。以此条件提取台农、贵妃、金煌芒芒果皮中的多酚，得到的多酚对羟自由基和DPPH自由基都有较强的清除作用。
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