陈 萍,王慧之,王德强,刘骏强
胃癌的全球发病率在癌症中居第5位,易导致患者死亡,预后不佳[1]。目前早期胃癌的诊疗以内镜下手术和外科手术为主,治疗可达到完全切除效果[2]。进展期患者失去了胃癌根治机会,存在转移、复发可能,预后及生存质量远远不及早癌患者。
蛋白翻译后修饰是肿瘤表观遗传改变研究的重要领域之一,其中甲基化、磷酸化、羟基化等修饰形式受到广泛关注[3]。蛋白质精氨酸甲基转移酶家族(protein arginine methyltransferases,PRMTs)被认为将甲基转移至精氨酸残基上,通过不同的甲基化修饰影响肿瘤细胞发生发展[4]。依据催化形成的不同产物,PRMTs家族大致分成4型,其中Ⅱ型PRMTs主要催化修饰形成对称性二甲基,包括PRMT5和PRMT9[5]。有研究[6]表明PRMT5在肺癌细胞中高表达,促进肺癌转移。同时有研究[7]表明PRMT5通过ERK信号通路促进肝癌细胞增殖,另外,PRMT5是乳腺癌干细胞增殖以及自我更新的重要调控因子[8],因此,PRMT5扮演着癌基因角色,以PRMT5作为靶点的分子抑制剂的抗肿瘤研究也日益增多[9]。该研究通过相关肿瘤数据库分析PRMT5在胃癌组织中表达,体外实验分析PRMT5在不同胃癌细胞株中的表达差异及其相关生物学作用,进而为胃癌诊疗提供可行性参考依据。
1.1 材料人源胃癌细胞(AGS、BGC823、SGC7901、MGC803)均来自江苏大学医学院实验室细胞保存库。质粒均由江苏大学医学院基础研究所保存提供。胎牛血清购自美国Gibco公司,PRMT5抗体购自美国Santa Cruz公司,基质金属蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP2)、基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)、上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关蛋白抗体以及内参抗体β-Tubulin均购自美国CST公司,蛋白Marker 以及Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司,ECL发光液购自美国Millipore公司,CCK-8试剂盒购自上海酶联生物研究所。
1.2 方法
1.2.1质粒转染 将细胞消化接种培养,待其铺满约60%单孔面积可开始转染。把5 μl的LipofectamineTM2000与2 μg质粒各自加进含有100 μl培养液灭菌EP管中,各自充分重悬后放置5 min,将两者轻柔充分混合并静置25 min。随后吸取转染试剂和质粒的混合液加进细胞培养板中,放入温箱里孵育6 h。
1.2.2细胞克隆形成实验 将细胞消化种板后放置温箱中孵育培养,间隔2 d行半换液,约2周待细胞克隆集落出现后移去培养基,用PBS轻柔清洗,沿板壁添入提前配制的4%多聚甲醛试剂固定细胞30 min,PBS洗涤2次,控干并添加0.1%结晶紫试剂,室温控干后在显微镜下拍照后计数。
1.2.3Transwell迁移实验及侵袭实验 将细胞消化种板后放置温箱中孵育培养。各组消化计数 50 000 个/孔种于Transwell小室中,并以5%胎牛血清配置的条件培养基定容为200 μl,下室则以10%胎牛血清配置的条件培养基定容为800 μl。放置12 h后移出小室,使用棉签小心擦拭上室底膜,孔内沿板壁加入多聚甲醛试剂,30 min后弃液加入结晶紫试剂,控干后将下室放在显微镜下计数。侵袭实验中提前使用基质胶在小室底膜加入100 μl, 于37 ℃中静置30 min待其凝固,剩余步骤同上。
1.2.4CCK-8实验 将细胞消化种板后放置温箱中孵育培养。各组消化计数1 000个/孔种在96孔板内,同时设置5个复孔。在温箱中孵育24、48、72、96 h等不同时间段,按照说明书分别在每孔加入10 μl CCK-8试剂并在温箱中避光培育2 h, 随后立即测450 nm处的吸光度。
1.2.5定量PCR实验 使用RNeasy Minikit试剂盒分离总RNA后反转录成cDNA。使用SYBRGreen PCR Master Mix进行实时PCR,并通过ABI Prism 7900工具进行分析。PRMT5引物正向序列为5′-CGATCAGACCTACTGCTGTCA-3′,反向序列为5′-CTCGGAGTTCCTGCGAATCT-3′;GAPDH引物的正向序列为5′-GCCACCCAGAAGCATGTGGATGGC-3′,反向序列为:5′-CATGTAGGCCATGAGGTCCACCAC-3′。
1.2.6蛋白免疫印迹法 用预冷PBS洗涤培养板,按配比加入提前煮沸的2×SDS-Loading Buffer细胞裂解液,随后用细胞刮仔细刮下孔内贴壁细胞,将混合液体吸入准备好的EP管中,随后将其放进100 ℃容器内5 min,瞬离EP管10 s,使用超声破碎EP管内细胞10 s,将EP管在4 ℃、11 000 r/min离心10 min,最后标本置于冰箱冷冻后择期尽快实验。按照说明书准备试剂分别制备不同浓度的分离胶和浓缩胶,提前取出所需蛋白样品室温融化并瞬离10 s,在胶孔内加入样本蛋白后进行电泳及转膜。依据蛋白分子量和Marker切取所需检测条带,室温下用5%脱脂奶粉封闭2 h,在目的蛋白条带上滴加相应抗体,4 ℃下摇床过夜,次日TBST溶液清洗条带后按配比滴加适量的二抗,将条带放置摇床上室温孵育2 h,用TBST溶液清洗。最后配制好一定量的显影液,曝光条带显色。
1.2.7生信GEO数据库分析 从GEO数据库中搜索“Gastric Cancer scRNA”后下载GSE134520数据集的数据,读入矩阵后使用Seurat工具创建对象后对其进行聚类降维,将所需数据样本来源进行可视化,绘制成小提琴图和直方散点图。
2.1 GEO数据库研究PRMT5在胃癌组织中表达胃癌前病变包括肠化生(intestinal metaplasia,IM)和慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG),该研究在数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)读取GSE134520数据集,该数据集分别对3例慢性非萎缩性胃炎(non-atrophic gastritis,NAG)、3例慢性萎缩性胃炎、6例肠上皮化生、1例早期胃癌(early gastric cancer,EGC)患者的胃病理组织进行单细胞RNA测序,通过该数据集的结果分析显示PRMT5在慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎至肠上皮化生逐级演变至早期胃癌中均有表达,其中在早期胃癌及胃癌前病变组织中表达较慢性非萎缩性胃炎增高,并且早期胃癌组织中表达水平最高。见图1。
2.2 Ualcan、HPA数据库研究PRMT5在胃癌组织中表达通过数据库(http://ualcan.path.uab.edu)继续研究正常胃和胃癌组织中PRMT5在mRNA表达水平,统计结果显示胃癌组织中PRMT5在mRNA水平高于正常胃组织(图2A),而且在不同肿瘤TNM临床分期(Stage1～4)胃癌组织中的PRMT5在mRNA水平均高于正常胃组织(图2B)。通过数据库(http://Human Protein Atlas)分析PRMT5在正常胃组织和胃癌组织中的蛋白表达情况,结果显示胃癌组织中PRMT5蛋白水平明显高于正常胃组织(图2C)。
2.3 PRMT5在胃癌细胞中的表达水平为了继续探究PRMT5在胃癌发生发展中的作用,首先通过Western blot测定PRMT5在4种不同胃癌细胞(AGS、BGC823、SGC7901、MGC803)中蛋白表达水平,结果显示,PRMT5在MGC803细胞株中表达最高,在AGS细胞株中表达最低(图3A)。
图3 PRMT5在胃癌组织中的表达水平
该研究在相对高表达PRMT5的MGC803细胞株中通过质粒(sh-PRMT5)敲低PRMT5表达水平,为了验证质粒干扰效率,筛选稳转细胞株后,通过Western blot以及Real-time PCR分别检测PRMT5在MGC803中蛋白及mRNA表达水平,结果显示,与对照组sh-EGFP组相比, sh-PRMT5组PRMT5细胞中蛋白及mRNA水平明显降低(P<0.05)(图3B)。同时在相对低表达PRMT5的AGS细胞株中通过质粒(pHA-PRMT5)促进PRMT5表达,为了验证质粒过表达效率,筛选稳转细胞株后,通过Western blot以及Real-time PCR分别检测PRMT5在AGS中蛋白及mRNA表达水平,结果显示,与对照组pHA-Venus组相比, pHA-PRMT5组细胞中PRMT5蛋白及mRNA水平明显升高(P<0.05)(图3C)。
2.4 PRMT5对胃癌细胞增殖的影响利用CCK-8实验以及克隆实验分析PRMT5对胃癌细胞增殖能力的影响。敲低PRMT5表达后,与对照组sh-EGFP相比, 实验组sh-PRMT5组细胞增殖率明显下降(P<0.001)(图4A),同时sh-EGFP组(225±23)比sh-PRMT5组(128±13)细胞克隆数目减少(t=6.359,P<0.01)(图4B)。增强PRMT5表达后,实验组pHA-PRMT5细胞增殖率较对照组pHA-Venus明显升高(P<0.001)(图4C),同时pHA-PRMT5组(310±25)比pHA-Venus组(104±9)细胞克隆数目增多(t=13.43,P<0.001)(图4D)。
2.5 PRMT5对胃癌细胞迁移与侵袭的影响利用划痕实验探究PRMT5对胃癌细胞迁移能力的影响。敲低PRMT5表达后24 h,sh-PRMT5组细胞迁移速度低于sh-EGFP组(t=25.98,P<0.001)。过表达PRMT5后24 h,pHA-PRMT5组中细胞迁移速度明显高于pHA-Venus组(t=5.824,P<0.01)(图5A)。继续通过Transwell试验验证PRMT5对胃癌细胞迁移能力以及侵袭能力的影响。敲低PRMT5表达后,sh-PRMT5组细胞迁移(84±5)(t=21.17,P<0.001)及侵袭数目(108±7)(t=16.81,P<0.001)小于sh-EGFP组迁移数目(336±20)和侵袭数目(360±25)。过表达AGS细胞株PRMT5后,pHA-PRMT5组中细胞迁移(192±11)(t=22.79,P<0.001)以及侵袭(168±10)(t=24.12,P<0.001)数目大于pHA-Venus组迁移数目(38±4)和侵袭数目(26±2)(图5B)。
图5 PRMT5促进胃癌细胞迁移与侵袭
利用Western blot分析各组胃癌细胞中MMP2和MMP9侵袭蛋白的表达,继续验证PRMT5促进胃癌细胞的侵袭。结果显示:敲低PRMT5表达后,与对照组相比,sh-PRMT5组细胞MMP2和MMP9侵袭蛋白表达水平下降。而增强表达PRMT5后,与对照组相比,pHA-PRMT5组细胞MMP2和MMP9侵袭蛋白表达水平升高(图5C)。
2.6 PRMT5对胃癌EMT的影响利用Western blot实验检测PRMT5对胃癌上皮细胞相关蛋白和间质细胞相关蛋白表达影响。实验结果显示,与sh-EGFP组相比, 敲低PRMT5表达后sh-PRMT5组N-cadherin、β-catenin、Vimentin等间质细胞相关蛋白表达明显下降,而上皮细胞蛋白E-cadherin表达水平上升(图6A);同时与pHA-Venus组相比, 过表达PRMT5后pHA-PRMT5组N-cadherin、β-catenin、Vimentin等间质细胞相关蛋白表达明显升高,而上皮相关蛋白E-cadherin水平明显下降(图6B)。结果显示,PRMT5可以促进胃癌细胞EMT过程。
图6 Western blot检测PRMT5对胃癌细胞EMT相关蛋白表达影响A:MGC803;B:AGS
胃癌一直是威胁人类生命健康的严重疾病之一,虽然近年因生活条件的改善,内镜检查需求较前增多,胃癌患病率及病死率较前有所下降,5年生存率相对升高,但由于胃癌患者早期仅有嗳气、饱胀等不典型临床表现,同时部分患者对内镜检查存在恐惧心理,当患者出现腹痛加重、呕血黑便、体质量明显减轻等严重症状时,往往已错过最佳手术诊疗时期且预后差,由此可见早期胃癌的诊断尤其重要。临床中除传统的放疗化疗外,免疫治疗、分子靶向治疗、术前新辅助治疗等手段也发挥重要作用。胃癌的局部进展以及转移一直是学术界关注的焦点,其相关的蛋白以及分子靶点具有一定的研究潜力。PRMT5是一种将精氨酸残基催化形成对称二甲基化的相关蛋白,在家族中属于Ⅱ型。近年来研究显示该蛋白在不同肿瘤的发生发展中具有重要作用,如肺癌[10]、乳腺癌[11]、肝癌[12]、胰腺癌[13]。作为热点肿瘤癌基因,可继续研究其在胃恶性肿瘤发生演变中的作用。该研究首先通过生信分析显示PRMT5在早期胃癌组织中表达较慢性萎缩性胃炎以及肠化生癌前病变组织表达升高,通过不同数据库检索,与正常胃黏膜组织进行比较后显示,各个胃癌分期组织中PRMT5在mRNA以及蛋白表达水平升高,由此该实验提出假说PRMT5在胃癌的演变进展机制中具有相关作用。通过Western blot测定PRMT5在4种不同胃癌细胞中蛋白表达水平,由此该实验选出PRMT5表达量较高的MGC803细胞株与表达量较低的AGS细胞株。随后该实验在MGC803细胞株中通过质粒(sh-PRMT5)敲低PRMT5表达水平并在AGS细胞株中通过质粒(pHA-PRMT5)促进PRMT5表达。稳定筛选及转染质粒后,该实验利用CCK-8与成克隆形成实验显示PRMT5具有提升胃癌细胞的增殖能力。同时在相关实验中表明PRMT5具有提升胃癌细胞的迁移能力和侵袭能力。该研究通过对胃癌细胞EMT相关上皮间质蛋白进行检测显示,PRMT5可以促进胃癌细胞EMT过程。
综上所述,该研究阐明了PRMT5对胃癌细胞具有促进其增殖、迁移、侵袭以及EMT能力,在胃癌的早期诊断以及预后评估中,PRMT5也有很好的研究前景,其相关机制仍需进一步研究。
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