吴亚锋 王楠楠 徐潆 金承玲 方苹
摘 要：
為调查2021年江苏省河蟹源气单胞菌属细菌的流行规律及特征，在江苏省泗洪、吴中、相城等20个县（市、区）采集河蟹样品进行气单胞菌的分离培养，采用16S rRNA基因特异性引物PCR扩增测序法进行种属鉴定，并进行体外药敏试验。结果显示，从河蟹的肝胰脏、鳃丝、肠道样品中共分离鉴定出气单胞菌182株，其中维氏气单胞菌的数量最多，占比最大（64%）。体外药敏结果表明，河蟹源气单胞菌分离株对恩诺沙星的耐药率最低，仅为4.95%，敏感率最高（86.81%）。比较2019-2021年耐药性数据，发现河蟹源气单胞菌近3年来对恩诺沙星的耐药率始终保持在较低水平；
与江苏省水产养殖中其他4个代表性品种日本沼虾、鲫、草鱼、克氏原螯虾相比，河蟹源气单胞菌的耐药性总体情况良好，耐药程度相对较低。研究结果可为该地区河蟹源气单胞菌引起的细菌性疾病的防治提供一定的用药依据。
关键词：
江苏省；
河蟹；
气单胞菌；
分离鉴定；
耐药情况
中图分类号：
S 917.1 文献标志码：
A 文章编号：
0253-2301（2023）05-0008-07
DOI：
10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.05.002
Analysis of the Situation of Drug Resistance of Aeromonas from River Crabs in Jiangsu Province in 2021
WU Ya-feng 1， WANG Nan-nan 2， XU Ying 2， JIN Cheng-ling 3， FANG Ping 1*
（1. Jiangsu Center for Control and Prevention of Aquatic Animal Disease， Nanjing， Jiangsu 210036， China;
2. College of Animal Science and Food Engineering， Jingling Institute of Technology， Nanjing， Jiangsu 210038， China;
3. Nanjing Jiangning District Aquatic Technology Promotion Station， Nanjing， Jiangsu 211100， China）
Abstract：
In order to investigate the prevalent rules and characteristics of Aeromonas bacteria from river crabs in Jiangsu Province， the samples of river crabs were collected from the 20 counties （cities， districts） in Jiangsu Province， such as Sihong， Wuzhong and Xiangcheng， etc.， for the isolation and cultivation of Aeromonas . The genus identification was conducted by using the PCR-amplified sequencing method of 16 S rRNA gene-specific primers， and the in vitro chemosensitivity test was also carried out. The results showed that a total of 182 strains of Aeromonas were isolated and identified from hepatopancreas， gill filaments and intestinal samples of river crabs， among which Aeromonas veronii accounted for the largest proportion （64%）. The results of in vitro chemosensitivity test showed that the isolated strains of Aeromonas from river crabs had the lowest resistance rate to enrofloxacin， only 4.95%， while the sensitivity rate was the highest （86.81%）. By comparing the data of drug resistance from 2019 to 2021， it was found that the resistance rate of Aeromonas from river crabs to enrofloxacin has remained at a relatively low level in the past three years. Compared with the other four representative species such as Macrobrachium nipponense， Carassius auratus ， Ctenopharyngodon idella and Procambarus shrimp in the aquaculture in Jiangsu Province， the overall conditions of the drug resistance of Aeromonas from river crabs was generally good， and the degree of drug resistance was relatively low. The research results could provide a certain basis for the prevention and treatment of bacterial diseases caused by Aeromonas from river crabs in the region.
Key words：
Jiangsu Province；
River crab；
Aeromonas ；
Isolation and identification；
Situation of drug resistance
江苏省拥有丰富的海洋和淡水资源，是中国重要的水产养殖基地。中华绒螯蟹，简称河蟹，是一种生活在河道、湖泊、池沼等淤泥河畔的大型甲壳类动物，拥有适温性广、饵料资源丰富、生长快速、养殖周期短、经济效益高等优点 [1] 。河蟹养殖是江苏省渔业中最具有特色以及影响力的产业之一 [2] 。全省养殖总面积达到26.67万hm 2，年产量约35万t，年产值超过了300亿元，均占全国总量的50%左右。然而，近年来逐渐增多的河蟹细菌性疾病给江苏省水产养殖业带来了巨大的损失。2019年刘肖汉等 [3] 在江苏省河蟹疫区进行测报，平均发病率为2.31%，死亡率为3.35%。
气单胞属细菌 Aeromonas 是一类条件致病菌，是我国水产养殖产业中细菌性传染病的主要病原体之一 [4] 。由该属细菌所造成的疾病类型复杂，并可透过水生动物、水产品传染人畜，造成人畜腹泻、食物中毒，危害人体健康 [5-6] 。2015年曹海鹏等 [7] 从患病中华绒螯蟹体内分离出1株病原菌，分析结果表明该菌为点状产气单胞菌。2022年周丽颖等 [8] 从患病华绒螯蟹肝脏和胰腺中分离出1株优势生长菌，分析结果为豚鼠气单胞菌。朱成科等 [9] 从濒死鲫鱼的内脏中分离出1株维氏气单胞菌，经动物致病性试验检测发现该菌具有极强的致病力。
气单胞菌广泛存在于各个生态系统，如土壤、河水、海水等。除了引起水产动物感染之外，也被报道能够感染人类，引起胃肠炎、败血症和伤口感染等 [10] 。对感染气单胞菌水生动物的治疗，目前多以口服抗生素为主，但大量应用抗生素容易引起抗药性，同时水生动物体内的抗生素残留也成为一种食品安全隐患。目前，国内对于气单胞菌感染疾病的防治仍缺乏科学合理的药物防治指導，给水产养殖产业的健康发展带来了困难。若不能及时、有效地防治该病，将会对水生动物的健康造成极大的危害。为调查江苏省河蟹源气单胞菌的流行规律及特征，本研究于2021年在江苏省泗洪、吴中、相城、铜山、昆山等20个县（市、区）采集河蟹样品进行气单胞菌的分离培养，并进行体外药敏试验，以分析河蟹源气单胞菌分离株的耐药情况，指导养殖户科学规范用药。
1 材料与方法
1.1 试验材料
在江苏省泗洪、吴中、相城、铜山、昆山等20个县（市、区）采集河蟹发病样品，采样部位包括腮、肝胰腺、肠道等。
1.2 主要试剂
细菌基因组提取试剂盒、2× Taq Master Mix（Dye Plus）购于诺唯赞生物科技股份有限公司；
脑心浸液肉汤BHI（Brain Heart Iusion）购自英国Oxoid公司，LB琼脂平板、RS琼脂平板、BHI液体培养基均为自行配制。硫酸新霉素、氟苯尼考、恩诺沙星、甲砜霉素、盐酸环丙沙星、红霉素、盐酸土霉素和盐酸多西环素等8种抗菌素药物标准品购自南京鼎思生物技术有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 河蟹样品中菌株的分离纯化 对河蟹发病部位进行无菌处理，无菌蘸取腮、肝胰腺、肠道等病料，于LB固体培养基上划线接种，将平皿倒置放入37℃温箱恒温培养16～48 h。挑取典型单菌落置于新鲜BHI液体培养基中，37℃恒温培养16～24 h，继续挑取单独菌落于BHI平板上划线，放入37℃恒温培养16～24 h。再次挑取单个特征性菌落，进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察菌体染色形态。同时在BHI平板上划线分离，得到单一菌落后，放入BHI液体培养基中，37℃振荡培养12 h，-20℃冻存。
1.3.2 分离菌株16S rRNA基因PCR扩增及序列分析 使用细菌基因组提取试剂盒进行分离株基因组的提取，参照说明书进行。使用细菌16S rRNA基因的测序通用引物：27 F（5′ AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3′）与1492 R（5′ GGTTACCTTGTT ACGACTT 3′），引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，大小为 1：465 bp，退火温度为55℃，构建30 μL PCR体系进行PCR扩增。电泳完毕后将阳性PCR产物回收后送交生工生物工程股份有限公司（南京）进行序列测定，所得序列使用BLAST软件进行同源性分析。
1.3.3 分离菌株对8种抗菌药物的敏感性试验 分别对上述8种水产用抗菌药物开展耐药性监测。采用96孔药敏板法对河蟹源气单胞菌分离株进行最小抑菌浓度的测定。首先使用MH培养基溶解待供试药物，然后将其分别进行梯度稀释。阴性、阳性对照仅加入MH培养基，其余孔均加入不同浓度的药物和MH培养基。挑选BHI平板上的单菌落接种到适宜的液体培养基中，培养 4～6 h，用无菌液体培养基进行校正，使菌液调整为1.5×10 8 CFU·mL -1 。随后用生理盐水把上述菌悬液按1 ∶ 100的比例稀释后备用。将稀释液倒入一次性无菌V形槽内，使用排枪将稀释后菌液加入到药敏板中，每孔200 μL，使每孔菌液的终浓度约为10 6 CFU·mL -1 ；
阴性对照孔加生理盐水200 μL。将药敏板置于培养箱中合适温度下培养18～24 h后观察。经过肉眼观察证实无细菌生长孔中的最低药物浓度，即为该抗菌药物的最小抑菌浓度（minimal inhibit concentration，MIC）。以大肠杆菌ATCC 25922作为质控菌株。利用SPSS软件进行MIC 50 、MIC 90 （即能抑制50%或90%受试菌所需的MIC值）的统计分析。
參照2017年美国国家临床实验室标准委员会（CLSI）颁布的判断标准判定细菌对抗菌药物的感受性，经后续修改，判定标准见表1。若分离株对恩诺沙星的MIC值≥16，则认为该菌株对恩诺沙星具有耐药性；
MIC值为8，记为中介；
MIC值≤4，则认为该菌株对恩诺沙星敏感。根据表1判定各分离株对8种抗菌药物的感受性，并进行分离菌株对抗菌药物的耐药率、敏感率和中介率统计 分析。
1.3.4 耐药性情况比较分析 根据全国水产技术推广总站发布的《水产养殖动物主要病原菌耐药性监测报告（2015-2020年）》 [11] ，统计2019、2020年江苏省河蟹源气单胞菌分离株的耐药性情况，开展2019-2021年河蟹源气单胞菌对抗菌药物的耐药性变化分析。根据全国水产技术推广总站发布的《2021年全国水产养殖动物主要病原菌耐药性监测分析报告》 [12] ，统计不同水生动物来源的气单胞菌耐药性情况，开展不同来源气单胞菌对抗菌药物的耐药性差异分析。
2 结果与分析
2.1 河蟹样品中气单胞菌分离鉴定结果
在BHI固体培养基上，气单胞菌分离株的菌落呈圆形、中央微凸、表面光滑、呈淡黄色（图1）；
革兰染色后镜检结果为红色短杆菌，菌体两端钝圆。细菌分子生物学鉴定方法目前通用的是16S rRNA序列分析 [13] 。本研究对分离菌株进行16S rRNA基因扩增，结果显示，分离株在 1：500 bp下方有1条目的条带大小相一致的条带（图2）。将阳性PCR产物送样测序，利用BLAST比对确定 到种。
2.2 河蟹样品中气单胞菌分离株种类及组成分析
本研究自江苏省采集的河蟹样品使用16S rRNA 基因进行种属鉴定。由图3可知，从河蟹的肝胰脏、鳃丝、肠道样品中共分离鉴出气单胞菌科182株，其中维氏气单胞菌116株、嗜水气单胞菌25株、温和气单胞菌18株、豚鼠气单胞菌13株、杀鲑气单胞菌4株、斑点气单胞菌4株、异嗜糖气单胞菌2株。
2.3 河蟹源气单胞菌对抗菌药物的MIC值分析
182株河蟹源气单胞菌分离株对8种抗菌药物的MIC值见表2。恩诺沙星对气单胞菌分离株的MIC 50 最低，为0.1 μg·mL -1 ，其次为硫酸新霉素、氟甲喹和盐酸多西环素，分别为0.38、0.45、0.61 μg·mL -1 ，而对磺胺间甲氧嘧啶钠的MIC 50 最高，为21.64 μg·mL -1 ；
恩诺沙星对气单胞菌分离株的MIC 90 最低，为8.53 μg·mL -1 ，其次为硫酸新霉素，为10.76 μg·mL -1 ，而甲砜霉素、磺胺间甲氧嘧啶钠和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶对气单胞菌分离株的MIC 90 均达检测上限。
2.4 河蟹源气单胞菌对抗菌药物的感受性分析
参照表1中抗菌药物敏感性判定标准，根据表2中MIC值判定上述河蟹源气单胞菌分离株对抗菌药物的感受性。由图4可知，河蟹源气单胞菌对甲砜霉素、氟苯尼考和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率较高，分别为46.70%、36.26%和34.07%，最低的为恩诺沙星，仅为4.95%；
对恩诺沙星的敏感率最高，为86.81%；
对氟苯尼考的敏感率稍低，为55.49%，对甲砜霉素的敏感率最低，为47.80%；
对盐酸多西环素的中介率最高，达15.93%，表明具有很强的潜在耐药性，需要警惕耐药性的进一步提高。
2.5 2019-2021年河蟹源气单胞菌对抗菌药物的耐药性变化
比较2019-2021年江苏省河蟹源气单胞菌对抗菌药物的耐药率（表3），结果显示：3年来河蟹源气单胞菌对恩诺沙星、甲砜霉素和磺胺甲噁唑/ 甲氧苄啶的耐药率变化不大，其中对恩诺沙星的耐药率始终保持在较低水平；
对硫酸新霉素、氟苯尼考和盐酸多西环素的耐药率始终呈上升趋势，其中对硫酸新霉素的耐药率于2021年上升了10.27%（与2020年相比）；
对氟甲喹和磺胺间甲氧嘧啶钠的耐药率呈下降趋势，其中对氟甲喹的耐药率下降最多，3年总共下降了64.73%。
2.6 不同来源气单胞菌对抗菌药物的耐药性差异
根据《2021年全国水产养殖动物主要病原菌耐药性监测分析报告》，江苏省不同来源气单胞菌分离株对8种抗菌药物呈现不同程度的耐药性（图5）。其中，河蟹源气单胞菌对硫酸新霉素和磺胺类药物的耐药性最低，对氟苯尼考、盐酸多西环素和氟甲喹的耐药性也不高，而对恩诺沙星和甲砜霉素表现出较高的耐药性。从总体耐药性情况来看：日本沼虾＞鲫＞草鱼＞克氏原螯虾＞河蟹。在江苏省水产养殖中有代表性的5个水产品中，河蟹源气单胞菌的耐药性总体情况良好，耐药程度相对较低。
3 讨论与结论
气单胞菌是常见的水产致病菌，广泛存在于养殖水体中，对环境具有较强的适应能力 [14] 。该菌可感染多种水生动物引起暴发性传染性疾病，对水产养殖业的发展构成严重的威胁。由气单胞菌所引起的感染在感染性疾病中居于重要位置，尤其是对免疫力低下的水生动物影响十分明显，如常见的水生动物虾蟹、青鱼、泥鳅、鲫鱼等 [15-18] 。本研究自江苏省某市采集河蟹样品，从河蟹的肝胰脏、鳃丝、肠道样品中共分离鉴定出气单胞菌科182株，其中维氏气单胞菌116株，数量最多，占比最大（64%）。邓玉婷等 [19] 从广东的4个城市16个养殖户采集样品，分离出 1：143 株病原菌，鉴定出8种气单胞菌，其中维氏气单胞菌的占比也最大（60.28%）。徐先栋等 [20] 在山塘、池塘、鱼菜共生塘的水体与底泥中分离出气单胞菌，通过16S rDNA 鉴定，分离出细菌54株，其中气单胞菌23株，维氏气单胞菌株数最多，为12株。与本研究所得结果相比，尽管不在同一个地区，但这些数据均体现出维氏气单胞菌在养殖渔场中存在较多。在气单胞菌属细菌中，维氏气单胞菌是养殖渔场中鱼虾等水产动物常见的易感病原。周慧华等 [21] 对分离自河蟹的维氏气单胞菌的研究表明，该菌对河蟹具有较强的致病性。其次为嗜水气单胞菌（25株）和温和气单胞菌（18株），分别占14%和10%，其他还有豚鼠气单胞菌（7%）、杀鲑气单胞菌（2%）、斑点气单胞菌（2%）、异嗜糖气单胞菌（1%）。
赵贤亮等 [22] 研究表明，由于养殖中抗生素的滥用或错用问题，致使水产动物致病菌包括气单胞菌的耐药现象越来越严重。汪永禄等 [23] 对马鞍山地区66株环境源气单胞菌进行药敏试验，发现对环丙沙星的敏感率高达100%；
为了防止过度使用抗生素，应进行耐药性监测。而MIC值能更准确、更全面地反映抗生素感受性结果，因此在监测耐药性时，同时要将MIC值作为监测数据。药敏试验结果表明河蟹源气单胞菌分离株对8种抗菌药物呈现出不同程度的耐药性。其中，河蟹源气单胞菌对甲砜霉素、氟苯尼考和磺胺甲噁唑/甲氧苄啶的耐药率较高，而对恩诺沙星的耐药率最低。因此，河蟹源气单胞菌分离株对恩诺沙星的敏感性最高。
比较2019-2021年河蟹源气单胞菌对抗菌药物的耐药率可知，气单胞菌分离株对恩诺沙星的耐药率始终保持在较低水平；
对硫酸新霉素、氟苯尼考和盐酸多西环素的耐药率始终呈上升趋势。肖丹等 [24] 研究发现94%以上的菌株对新霉素敏感，而黄玉萍等 [25] 发现57株气单胞菌对新霉素的耐药率达到33.33%。本研究中2021年河蟹源气单胞菌分离株对硫酸新霉素的耐药率为14.29%。这说明不同地区、不同养殖品种、不同用药习惯，对水生动物病原菌的耐药性均有一定的影响。与2020年相比，2021年河蟹源气单胞菌对硫酸新霉素的耐药率上升了10.27 %，这提示须加强对抗生素的合理使用，以防止耐药性的进一步上升。气单胞菌分离株对氟甲喹和磺胺间甲氧嘧啶钠的耐药率呈下降趋势，其中对氟甲喹的耐药率下降最多，3年总共下降了64.73 %，这说明江苏已经开始重视抗生素的使用情况，并已经初具成效。来自不同养殖品种的气单胞菌分离株对于8种抗菌药物具有不同程度的耐药性，其中河蟹源气单胞菌对对硫酸新霉素和磺胺类药物的耐药率最低，且在江苏省水产养殖中有代表性的5个品种中，河蟹源气单胞菌的耐药性总体情况良好，耐药程度相对较低。
建议养殖户可选用恩诺沙星、硫酸新霉素和盐酸多西环素进行河蟹源气单胞菌感染的治疗，但必须严格按照药敏试验结果和药代动力学原理确定剂量和药程。因此应加强药敏试验的应用，为水产养殖用药指导，才能尽可能减少耐药病原菌的产生并保障水产品质量安全。
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（责任編辑：陈文静）
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