陈 慧 陈光辉 梁映亮 王万党 尹志军
（南方医科大学附属小榄医院，广东 中山 528415）
妊娠糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）是常见的妊娠期代谢紊乱综合征，发病率约为18%，近年来呈持续增高趋势[1]。GDM不仅可导致妊娠高血压、孕期感染、巨大胎儿、羊水过多、难产、新生儿肺透明膜病等母婴不良围生期结局，还可增加孕妇产后和婴儿肥胖、血脂异常、2型糖尿病等代谢异常风险[2]。除改变生活方式、服用降糖药和监测血糖外，目前尚无治愈GDM的方法和更有效的预防策略[3]。因此，探究GMD发病机制，开发新的治疗策略尤为重要。基因表达数据库（gene expression omnibus，GEO）是一个储存芯片、二代测序和其他高通量测序数据的数据库[4]。本研究利用GEO数据库整合GDM相关实验测序数据，进行生物信息学分析，确定关键基因，并评价其诊断效能，为GDM早期诊断和个体化预防、治疗提供更准确和可靠的生物标志物。
1.1 数据收集与处理
从GEO数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）下载与GMD相关的微阵列数据。入选标准：1）同时具有对照者和GMD患者样本；
2）样本总数≥20例。最终选取GSE103552数据集用于本研究，芯片平台为GPL6244，样本类型为胎儿胎盘内皮细胞，共37例，其中对照组17例[年龄（28.6±7.1）岁，身高（1.68±0.07）m，体重（81.9±3.6）kg，孕周（40.0±1.6）周]、GDM组20例[年龄（30.0±6.8）岁，身高（1.62±0.07）m，体重（83.4±3.3）kg，孕周（40.0±1.6）周]。2个组之间年龄、身高、体重、孕周差异均无统计学意义（P>0.05）。根据芯片对应的平台信息对芯片数据进行ID转换，采用R软件中的“limma”程序包进行校正。
1.2 差异表达基因获取与富集分析
采用R软件中的“limma”程序包分析GDM组和对照组差异表达基因，筛选标准为|log2FC|>1且P<0.05；
采用R软件中的“Clusterprofiler”程序包对差异表达基因进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。筛选标准设置为P<0.05，富集分析结果图由R软件中的“ggplot2” 程序包呈现。
1.3 WGCNA分析
使用R软件WGCNA数据包确定模块基因。使用网络拓扑分析确定软阀值，进一步构建共表达网络，确定模块和样本特征关系，找到所需的模块，输出模块基因。
1.4 蛋白互作网络分析和关键基因确定
取模块基因与差异表达基因的交集，并使用STRING数据库（https：//string-db.org/）构建蛋白互作网络，使用Cytoscape v3.8.2软件进行可视化处理，并使用Cytohubba插件的Degree方法筛选关键基因。
1.5 关键基因表达水平和诊断价值评价
采用R软件分析关键基因表达水平，采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线评价关键基因诊断GDM的效能。
2.1 差异表达基因分析
从GSE103552数据集中共获得GDM组与对照组差异表达的基因118个，其中表达上调65个、表达下调53个。见图1。
图1 GDM组和对照组差异表达基因的筛选
2.2 差异表达基因富集分析
差异表达基因GO富集分析和KEGG通路富集分析结果显示，差异表达基因涉及细胞外基质组织、细胞外结构组织和DNA构象变化等多个反应，主要调控RNA转运和味觉转导等多个通路。见图2。
图2 GDM差异表达基因涉及的生物学功能
2.3 WGCNA分析
R软件WGCNA程序包分析结果显示，本研究无离群样本，样本的聚类特征热图见图3（a）、（b）。
图3 GDM组和对照组WGCNA分析
使用网络拓扑分析确定13个模块的软阀值为8（r2=0.9）。根据软阈值构建共表达网络，分析样本特征与13个模块之间的关系，选择与GDM最显著相关的模块，确定为包含122个基因的模块（cor=0.52，P<0.001）。见图3（c）～（f）。
2.4 关键基因
取模块基因与差异表达基因的交集，得到33个特征差异表达基因。采用Cytohubba插件的Degree方法筛选关键基因，选择节点度最高的5个基因（ANKRD36C、CLK1、LUC7L3、NKTR和RSRP1）作为GDM关键基因。见图4。
图4 关键基因筛选
2.5 5个关键基因的表达水平和诊断GDM的效能
GDM组5个关键基因（ANKRD36C、CLK1、LUC7L3、NKTR和RSRP1）相对表达量均高于对照组（P<0.05）。见图5（a）。
图5 对照组和GDM组关键基因相对表达量比较及其诊断GDM的ROC曲线
ROC曲线分析结果显示，ANKRD36C、CLK1、LUC7L3、NKTR和RSRP1诊断GDM的曲线下面积分别为0.891、0.818、0.909、0.891和0.885。见图5（b）。
GDM是一种以胰岛素抵抗、胰岛β细胞代偿不足为主要特征的妊娠并发症，目前尚无有效的诊疗方法[5]。ZHAO等[6]通过WGCNA分析筛选出10个与GDM病理进程相关的候选基因。CHEN等[7]通过WGCNA分析筛选出5个与GDM病理进程相关甲基化程度高的低表达基因（ABLIM1、GRHL1、HLA-F、NDRG1和SASH1）和1个甲基化程度低的高表达基因（EIF3F）。尹志芳等[8]通过分析GDM相关基因表达数据集GSE51546和GSE87295发现7个差异表达基因，分别为CD34、TACSTD2、LDB2、CLDN5、NTN4、COLEC12和IGFBP6。本研究通过分析GSE103552数据集获得5个在GDM中呈高表达的关键基因（ANKRD36C、CLK1、LUC7L3、NKTR和RSRP1），均具有较高的诊断价值。但应注意的是，因不同研究的样本信息来源和数据不同，所以可能导致得出的差异表达基因完全不同。
在妊娠末期，胎盘内皮细胞对胎盘功能的调节有重要意义，GDM患者胎盘内皮细胞功能受损，且有408个基因发生改变[9]。ZHU等[10]的研究结果显示，GDM患者胎盘内皮细胞中有2 095个基因表达上调，3 117个基因表达下调。本研究结果显示，GSE103552数据集中有65个基因表达上调，53个基因表达下调。由此可见，胎盘内皮细胞基因水平异常可能会导致其功能受损，这些差异基因或可作为GDM潜在的诊断标志物。
本研究通过生物信息学分析获得5个GDM的关键基因，分别为ANKRD36C、CLK1、LUC7L3、NKTR、RSRP1。这5个关键基因在GDM中的表达水平和调控机制还需进一步研究。在血栓性血小板减少性紫癜患者体内存在ANKRD36C变异，与炎症相关；
GDM常常伴随过度的炎症反应，抑制炎症反应可以缓解GDM病情，提示GDM中高表达的ANKRD36C可能与GDM过度炎症有关[11]。过度的胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足均与GDM发生密切相关，胰岛素可促进丝氨酸/苏氨酸激酶2磷酸化，敲低AKT2会促进CLK1表达，提示胰岛素分泌不足会导致GDM患者CLK1水平上调，但CLK1在GDM疾病进程中的调控机制还需进一步研究[12]。同样，LUC7L3作为致癌基因参与了调控胰岛素抵抗[13]，但其在GDM中的作用尚未见报道。本研究发现，LUC7L3与GDM病理变化有关。有研究通过WGCNA分析发现NKTR基因参与了疾病病理进程[14]，但其在GDM中的作用亦未见报道。RSRP1位于1号染色体，目前对其功能的研究较少[15]。
综上所述，本研究采用生物信息学分析方法，在GSE103552数据集中获得5个GDM关键基因（ANKRD36C、CLK1、LUC7L3、NKTR和RSRP1）。5个关键基因在GDM中表达均上调，诊断GDM的AUC均>0.8。但本研究尚有一定的局限性：本研究利用生物信息学技术筛选GDM关键基因，并分析其诊断价值，但未进行临床样本验证，胎盘内皮细胞差异基因分析还处于临床前研究，目前尚不能用于常规临床诊断；
本研究所有分析均基于GSE103552数据集，目前GEO数据库中尚无中国汉族人群GDM微阵列数据。因此，这5个关键基因在GDM中的表达水平和调控机制还需进一步研究。