马玲 杜明华 孟露 杨甜 吴龙国
摘要：葉绿素是植物生长发育必不可少的色素，可用来衡量植物生长状况，为实现番茄叶片叶绿素含量快速、无损检测，以番茄为试验材料，通过高光谱无损检测方法，对番茄叶片叶绿素含量进行监测。提取出82个叶片样本的平均光谱反射率数据（400～1 000 nm），对原始光谱数据分别进行7种预处理（平均平滑、高斯滤波、中值滤波、卷积平滑、归一化、基线校准（baseline）、标准正态化（standard normal variation，SNV），建立PLSR模型，建模结果显示：SNV预处理光谱的建模效果最优。用β权重系数、无信息变量消除变换法（uninformation variable elimination，UVE）、竞争自适应重加权法（compet-itive adaptive weighted sampling，CARS）及连续投影算法（successive project-ion algorithm，SPA）等提取特征波长，并建立了PLSR模型，建模结果表明：CARS法提取特征波长所建立的模型最优，CARS法提取了8个特征波长（732、796、946、953、957、968、983、994 nm）被应用于建立番茄叶片叶绿素定量预测模型。为选出最优的建模方法，使用MLR、PCR、PLSR与SVR方法分别对CARS提取的特征波长进行模型对比，优选出的MLR模型用于预测番茄叶绿素含量，最优预测模型MLR的相关系数Rc、Rcv分别为0.830、0.743，均方根误差RMSEC、RMSECV分别为2.126、2.365。这可为今后在线监测植物长势提供技术支撑。
关键词：高光谱成像；
番茄叶片；
叶绿素；
无损检测
中图分类号：S641.201文献标志码：A文章编号：1002-1302（2023）11-0167-07
番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）别称西红柿，成熟的果实可食用，口感好，养分足［1］，是我国北部设施种植的主要蔬菜和消费最多的园艺产品之一，也是世界上广泛栽培和使用最多的果菜类蔬菜。氮素是作物生长发育过程中不可缺乏的一种养分［2］。氮是叶绿素、植物素等的重要成分［3］，而植物叶片叶绿素浓度影响着植物光合效果，其含量高低与植株营养状况和发育阶段密切相关，成为评估作物长势以及受胁迫程度的重要指标［4］。检测叶绿素含量的传统方法存在损坏样本、费时、检测效果低、不能及时反映作物生长状况与受害情况的缺陷［5］。高光谱成像技术具备了高速、无损、成本低的特性，可以直接对植物进行微弱光谱特征的定量分析研究［6］。国内外诸多学者已经开始利用高光谱成像技术对作物的水分、叶绿素含量等植物营养元素进行无损监测［7-9］。学者通过一些高光谱参数，探索了植物的叶绿素、氮素含量等［10-11］。Sun等使用高光谱成像技术，对桃子叶绿素浓度进行了监测［12］。Singh等采用无损检测技术建立高粱SPAD值预测模型［13］。Madeira等对四季豆光谱辐射与叶绿素含量之间的关系进行探索研究，指出四季豆叶片叶绿素浓度的无损检测能够通过高光谱成像技术实现［14］。Annala等在训练卷积神经网络反演叶绿素浓度的试验中，提出了利用高光谱技术就可以对作物叶绿素含量作出合理评价［15］。学者也建立了油茶［16］、冬小麦［17］、马铃薯［18］、水稻［19］等叶绿素含量估测模型。上述研究成果都显示高光谱成像技术已经能够对植物营养元素进行无损测定。但用高光谱成像技术检测番茄叶片叶绿素含量的研究成果较少，本研究以温室番茄作物为试验材料，通过高光谱成像技术，对不同浓度氮素营养液灌溉下的番茄叶片中叶绿素含量进行研究，结合多种光谱和图像处理方法以及化学计量方法，研究了不同预处理方法和特征波长提取，对比分析了几种建模方法的有效性，优选最佳预测番茄叶片叶绿素含量模型。
1材料与方法
1.1试验材料
供试番茄选用博美2号品种，购置于宁夏天缘种业有限公司，共计50株番茄幼苗，于2021年7—11月在宁夏园艺产业园日光温室中进行，采用营养液培育。本研究设置10个施氮水平，每一个施氮水平下，保证其他必需营养元素施用量相同，采用水培方式进行试验。营养液配方为日本园艺营养液［20］（表1）；
试验过程中利用1/2单位的日本园艺营养液培育番茄植株。共10个水培箱，每个水培箱是一个水平处理，每个箱子里面培育5株幼苗。
1.2试验方法
1.2.1叶绿素含量测定方法使用便携式叶绿素测定仪（SPAD-502Plus，日本柯尼卡美能达）对叶片叶绿素含量进行测定。测定时间：上午09：00—11：00，每株番茄选择2张叶片，所选择的样本叶片生长健康，完好无损，直接用叶绿素计测定SPAD值，每张叶取3个点测定，并记录SPAD值，共82个样本。
1.2.2高光谱成像系统与参数设置可见近红外波段高光谱成像系统（波段范围：400～1 000 nm），设备型号为GaiaField-F-V10，四川双利合谱科技有限公司生产，共有176个波段，光谱分辨率为 3.8 nm。进行了多次重复测试，以避免环境因素带来的图像像素变低等问题，在 12：00—16：00时间段进行番茄叶片的采集，并设定了最佳采集参数条件：物距为360 mm，扫描速度设置为0.147 cm/s，成像光谱仪曝光时间为10 ms。
1.2.3数据分析方法由于高光谱图像是三维数据，信息量冗余，同时原始光谱存在基线漂移，需对原始光谱进行预处理，为模型构建提供基础。数据分析处理中，用UnscramblerX 10.4进行数据预处理和预测模型构建，采用MatlabR2014a进行特征光谱获取、图像构建。
常见的光谱预处理：高斯（GF）滤波平滑、标准正态变化（SNV）等。光谱预处理方法均有减弱因仪器噪音、暗电流、多重共线性以及背景影响因数等使得光谱曲线受到限制的目的［21-23］。特征光谱信息提取可以在进行降维的同时给予在线应用理论基础。本研究采用权重系数法（BW）、竞争性自适应重加权算法（CARS）、无信息变量信息消除法（UVE）、连续投影算法（SPA）［24-25］。在叶片叶绿素的定量模型建立方面，则着重采用了多元线性回归（MLR）、主成分回归分析（PCR）、偏最小二乘回归（PLSR）、支持向量机回归（SVR）及人工神经网络（ANN）等方式。模型的有效性，由相关系数（R）和均方根误差（RMSE）进行综合评价。R值越高、RMSE值越低，所形成的模型的有效性越好［26-27］。
2结果与分析
2.1图像变换
由于在图像采集过程中，会遭遇到外界条件的障碍，使得得到的图像效果差，须对图像进行预处理。通过高光谱成像设备分别对不同处理下的图像进行图像采集，通过Envi 4.8软件中的图像变换功能，对原始图像分别进行了归一化、平方根等处理，结果见图1。
由图1可知，对比分析不同图像预处理，归一化处理可以很好地与背景分开，且叶片轮廓清晰，所以采用归一化处理后的图像提取特征波长。
2.2特征提取
采用阈值分割的方法对原始图像进行处理。使用便携式高光谱图像装置对番茄的叶片进行采集，并选用黑色塑料作背景，以方便于后期进行图片提取。通过Envi 4.8软件可以提取扫描图片的特征光谱，从而获得叶子的感兴趣区域（ROI），再通过获取高光谱图片中叶子、白板、背景的特征光谱，进而获取叶片感兴趣区域，最终得到特征曲线图（图2）。对比分析叶片、白板、背景的光谱反射率，优选出800 nm图像进行阈值分割，并提取叶片光谱。对800 nm下的图像进行反复的测试，阈值范围确定为0.1～0.4，可以得到叶片的完整信息，图像掩模的过
程见图3。
2.3光谱数据采集
通过Envi 4.8软件对掩模后的番茄叶片高光谱图像进行光谱信息提取，得到10个施氮水平下的
原始光谱曲线（图4）。
由图4可知，由于0、1、2、4、6水平下的光谱曲线存在漂移现象，于是便对光谱曲线进行预处理。10个施氮水平下叶片的光谱曲线走势一致，660 nm处有吸收峰，这主要是由于叶片中叶绿素的吸收。由于采集得到的光谱中，除吸收叶绿素外，还有其他物质的吸收，因此，须要对光谱数据进行解析，通过化学计量学方法建立与叶绿素相关性高的预测模型。
2.4化学值测定
每个氮素水平下选取2～5株健康番茄，每株选择2张无病虫害、无机械损伤的叶片，每张叶片选择3个点进行测量，并记录SPAD值，共测得82个样本的叶绿素含量。采用SPSS 20.0软件和Excel软件对10个施氮水平下番茄叶片的叶绿素含量进行单因素方差分析，结果见图5。
由图5可知，1、6水平下番茄叶片的叶绿素含量与其他8个施氮水平下的叶绿素含量差异显著（P<0.05）；
2、4、10水平下植株叶片叶绿素含量差异不显著（P>0.05）；
8水平下的植株叶片叶绿素含量与其他9个施氮水平均存在显著性差异（P<0.05），此施氮水平下植株叶片叶绿素含量值为41.03 mg/g；
12水平下的叶绿素含量为41.53 mg/g；
14水平下番茄叶片的叶绿素含量与其他施氮水平下的叶绿素含量之间存在显著性差异（P<0.05），此水平下测得的番茄叶片叶绿素含量为36.3 mg/g；
同时，在1～4水平下，番茄叶片叶绿素含量随着氮素浓度的增加而增多，其中0水平下的番茄叶片叶绿素含量最低，其值为35.45 mg/g，16水平下叶绿素含量最高，为41.64 mg/g。
2.5模型建立
2.5.1样本划分本研究中共有82个番茄叶片样本，取其中的3/4作为训练集，1/4为预测集。分别采用random sampling（RS），Kennard-Stone（KS）、sample set partitioning based on joint x-y distance（SPXY）［28］ 3种方法选取训练集和预测集，然后分别对这3种方法所获得模型的结果进行判断，模型的有效性由训练集样品的相关系数（correlation coefficient of calibration set，Rc）、训練集样品的均方根误差（root-mean-squares error of calibration set，RMSEC）、交互验证相关系数（correlation coefficient of cross-validation，Rcv）、交互验证均方根误差RMECV、预测集样品的相关系数（correlation coefficient of forecast set，Rp）、预测集样品的均方根误差（root-mean-squares error of forecast set，RMSEP）进行评价。由表2可知，在3种划分方法中，SPXY法的相关系数Rc、Rcv均高于RS法，其值分别为0.747、0.676，且均方根误差RMSEC、RMSECV均低于RS法，其值分别为2.314、2.574，预测集的相关系数Rp高于KS法，与RS法差异较小，其值为0.760，且预测集均方根误差RMSEP低于KS法。综合参数考虑，最终选择SPXY法划分番茄叶片叶绿素含量样本集。
2.5.2预处理优选为了避免受到光学频谱或图像信息中非品质信息的障碍，包括因测量仪器噪声和暗电压等原因而造成的光谱信号曲线基线偏移和不重叠现象、各种成份彼此间互相影响造成的多重共线性及其背景因数等对光谱信号曲线的制约［29］，对原始光谱进行平均平滑、高斯滤波、中值滤波、卷积平滑、归一化、基线校准（baseline）、标准正态化等预处理，并对比分析其模拟的有效性。
试验采用7种不同算法基于叶片叶绿素含量原始光谱进行预处理，并基于每种方法建立PLSR模型。由表3可知，与原始光谱结果进行比较，5种归一化（面积归一化、单位向量归一化、平均归一化、最大值归一化、阈值归一化）和baseline预处理后的
预测集相关系数值均有所降低，建模效果都有一定的下降，最小值为0.725，标准正态化建模之后，预测集相关系数有所增加，模型性能有所提高。采用标准正态化预处理法得到的相关系数Rp均高于原始光谱和其他预处理光谱，Rp值为0.810，且均方根误差RMSEP也最低，其值为3.820；
综合分析，优选SNV法建立叶片叶绿素含量PLSR模型。
2.5.3特征波长提取分析为了降低数据冗余，便于应用到实际生产中。利用UnscramblerX10.4软件结合MatlabR2014a软件对原始光谱数据进行特征波长提取。特征波长获取方式主要有PLSR β权重系数、SPA、UVE及CARS等，通过这几种方法获取的特征波长存在差异，具体结果如下：通过β权重系数法提取了8个波段（430、580、659、683、702、810、864、909 nm）；
SPA法提取了4個特征波长（796、909、957、991 nm）；
UVE法提取了17个波段（427、430、433、551、554、721、725、728、732、792、796、864、916、923、957、983、987 nm）；
CARS法提取了8个特征波长（732、796、946、953、957、968、983、994 nm）。对比分析得出CARS法提取的8个特征波长所建立的番茄叶片叶绿素定量模型具有较好的预测效果。
2.5.4特征波长下建立模型为分析4种获取特征波段方式，通过PLSR方法对建模模型的有效性进行分析，结果见表4。由表4可知，CARS与其他提取特征波段方法相比，其建立的模型的相关系数Rc、Rcv均高于其他3种算法构建的模型；
其建立模型的均方根误差RMSEC、RMSECV值均比以上几种建模方法低，但相关系数Rp较小，综合分析，CARS法建立的模型效果优于其他3种方法所构建的模型，说明可通过CARS法提取特征波段，而CARS法提取的8个特征波长可用于建立番茄叶片叶绿素定量预测模型。
2.5.5不同模型对比分析通过线性回归（MLR、PCR、PLSR）与SVR方法分别对CARS提取的特征波长进行模型分析，以便选出最优特征波长模型，结果见表5。
由表5可知，MLR、PCR、PLSR所建立的模型的Rc、Rcv值都高于SVR所建立的模型，但3种线性回归所建立模型的Rp值均小于SVR；
MLR、PCR、PLSR所建立的模型的RMSEC、RMSECV、RMSEP值均低于SVR所建立的模型，说明3种线性回归建模效果优于SVR。而在MLR、PCR、PLSR所建立的模型中，PCR和PLSR所创建模型的相关系数和均方根误差相差不大，而MLR所建立的模型的Rp值都比PCR、PLSR所建立的模型高，RMSEP值均小于PCR、PLSR所创建的模型，综合分析，MLR的有效性优于PCR和PLSR，这为今后番茄叶片叶绿素含量在线监测给予多种选择。
3结论
试验对施用不同氮素下的番茄叶片进行研究，探讨了7个处理下番茄叶片的光谱提取方法、异常样本提出、特征波长提取以及优化建模方法，取得了以下结果：
预处理方法的选择，在一定的程度上可以改善光谱信息中参杂的噪音干扰；
而试验中光谱预处理未能取得预期效果，这与光谱自身有关。CARS法提取的8个特征波长（732、796、946、953、957、968、983、994 nm）所建立的番茄叶片叶绿素定量模型，具有较好的预测效果。本研究对比分析番茄叶片叶绿素的线性回归与非线性回归模型，得出番茄叶片叶绿素的线性回归模型能取得较高的预测效果，而最优预测模型为MLR，其中校正集相关系数Rc为0.830，RMSEC为2.126；
预测集相关系数Rcv为0.743，预测RMSECV为2.365，因此最终选择MLR模型进行番茄叶片叶绿素含量在线预测，这也可为番茄植株其他指标的快速检测提供借鉴。
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