余丽娜 阎升光 谢丹 高升 叶政 陈姿任 王梓桦 欧阳石
1华北理工大学公共卫生学院（河北唐山 063210）；
广东高校生物靶向诊治与康复重点实验室，广州医科大学附属第五医院2感染科，3中医科，4超声科，5急诊科（广州 510700）
自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是T 细胞介导的慢性免疫炎症性疾病，女性多发，表现为高丙种球蛋白血症、血清抗核抗体和/或抗平滑肌抗体的存在，以及界面性肝炎［1］。肝脏移植是AIH 发展为肝硬化不可避免的治疗选择，但因其来源难且复发率高已严重危害患者生命［2］。因此，开发安全有效的药物以提供有效的治疗方案是至关重要的。
脐带间充质干细胞（UCMSCs）因其具有针对先天和适应性免疫系统中的免疫细胞的免疫调节特性，同时因其来源广、免疫原性低等优势已成为自身免疫性疾病的临床应用的最佳选择［3］。研究发现，UCMSCs 可通过对CD4+T 细胞分化的免疫调节，纠正Th17/Treg 的不平衡［4］。Th17/Tregs 免疫平衡在免疫介导的AIH 发病中至关重要。Tregs 作为CD4+T 细胞的一个亚群，通过释放抗炎因子如TGF-β1 来执行免疫抑制功能。当AIH 疾病活动时，Treg 的数量明显减少，血清中IL-17 和IL-6 以及肝脏内Th17 细胞的频率明显增加［5］。因此，以Treg/Th17 免疫平衡为目标可能为治疗AIH 提供一种有效的方法。然而，UCMSCs 调节AIH 免疫微环境中Th17/Treg 平衡的影响和分子机制的基础和临床研究却很少。
因此，本实验首先用PBMCs 模拟肝脏免疫微环境，观察UCMSCs 治疗对T 淋巴细胞分化的影响。由于Th17/Treg 分化受到复杂的细胞和转录因子的调控，进一步通过转录谱明确主要的差异基因，为进一步的临床研究提供理论和数据支持。
1.1 UCMSCs 获得在获得广州医科大学附属第五医院医学伦理委员会的批准（伦理批号：KY01-2021-09-09）及患者的知情同意的情况下，脐带取自健康足月孕妇，并在2 h 内于本院前沿医学交叉中心实验室进行UCMSCs 制备。
1.2 人外周血单个核（PBMCs）获得在严格遵守相关伦理原则的前提下，收集处于血清氨基转移酶和IgG 水平升高和/或肝组织学炎症活动的AIH患者外周血样本。所有研究对象均符合国际自身免疫性肝炎小组（IAIHG）规定的标准和2010 年美国肝病研究学会自身免疫性肝炎诊断与治疗指南及评分诊断标准。排除标准：合并PBC 或PSC 的重叠综合征；
2 个月内使用过血液制品；
1 个月内接受过糖皮质激素治疗或其他免疫抑制治疗。
1.3 主要实验试剂及材料人间充质干细胞无血清培养基（天津灏洋生物）；
RPMI 1640 培养基、胎牛血清（FBS）（Gibco）；
Transwell 小室（PC 膜，孔径0.4 μm）（Corning 公司）；
流式抗体CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD34、CD31、CD45、HLA-DR、CD25-APC、CD4-FITC、Foxp3-PE、CD3-FITC、CD8α-PerCP-Cy5.5、IL17A-PE（eBioscience 公司）；
TGF-1、IL-17 和IL-6 检测试剂盒（MultiSciences 公司）；
RORγt（ab113434）（Abcam 公司）；
Foxp3（#12632）、SMAD3（#9523）、p-SMAD3（#9520）、STAT3（#9139）、p-STAT3（#9145）（Cell Signaling Technology 公司）；
ECL 超敏化学发光液（美仑生物）；
反转录试剂盒及TB Green series 试剂盒（日本Takara 公司）。
1.4 实验仪器Western 电泳槽、转模槽及化学发光成像系统（美国Bio-rad 公司）；
流式细胞仪（美国BD Biosciences 公司）；
倒置显微镜（日本Olympus公司）；
荧光定量PCR 仪（美国罗氏生物公司）；
Agilent 2100 生物分析仪（美国Agilent）；
仪器HiSeq X Ten 系统测序平台（美国illumina 公司）。
1.5 实验方法
1.5.1 UCMSCs 的制备分离出Wharton 胶并切成1 mm3的泥块，均匀地铺在T75 培养瓶中，在无血清培养基中于37 ℃、5% CO2下培养7 d。达到80%汇合度后，对MSC 样细胞进行传代。本实验使用第3 ～6 代UCMSCs。
1.5.2 UCMSCs 的鉴定通过光镜显微镜观察UCMSCs 的形态特征。在流式细胞仪中使用CD29、CD73、CD90、CD105、CD34、CD31、CD45 和DR 抗体对UCMSCs 进行免疫表型鉴定。
1.5.3 PBMCs 的制备采用Ficoll-Hypaque 密度梯度离心法从AIH 患者外周血中分离PBMCs。在单个核细胞分离液液面加入用PBS 稀释的新鲜肝素抗凝全血，水平离心（800g，20 min，升降3）。可见血浆层与分离液层之间有一层薄较致密白膜为PBMCs，小心吸取白膜到含10%FBS 的1640 培养基中，离心去上清，洗涤两次，制成悬液。
1.5.4 构建UCMSCs/PBMCs 共培养系统将UCMSCs 接种于Transwell 小室上腔，PBMCs 细胞接种于下腔，细胞稳定后将UCMSCs 与PBMCs 共培养。UCMSCs/PBMCs 共培养系统分为3 组，包括PBMCs组、Co-culture 1 组（PBMCs∶UCMSCs=10∶1）和Coculture 2 组（PBMCs∶UCMSCs=5∶1）。共培养72 h后，收集PBMCs 和上清液进行后续分析。
1.5.5 流式细胞术检测Treg 和Th17 细胞的百分比PBMCs 用荧光偶联抗体着色，再用流式细胞仪进行分析。CD25+Foxp3+CD4+Treg 细胞先用CD4-FITC 和CD25 - APC 标记，Foxp3 抗原透化。CD3+CD8-IL-17A+Th17 细胞通过CD3-FITC 和CD8α-PerCP-Cy5.5 识别CD4+T 细胞，固定透化后用IL17A-PE 染色。
1.5.6 酶联免疫吸附试验（ELISA）检测相关细胞因子使用ELISA 试剂盒测定TGF-β1、IL-17 和IL-6 水平。在酶标仪测量450、630 nm 处的光学吸光度。
1.5.7 RNA 测序分析用TRIzol 对PBMCs 进行RNA 提取。Oligo（dT）磁珠富集mRNA。用mRNA的短片段作为模板，合成cDNA。经过纯化、末端修复和添加A-tail 后，进行PCR。使用Agilent 2100 分析仪对构建的文库进行了质量检查。使用HiSeq X Ten 系统对RNA 进行测序。转录组测序分析及生信富集分析由北京百迈客生物科技有限公司完成。设置参数：表达量倍数变化比值＞2和＜0.5 富集，差异有统计学意义（FC＞2 or FC＜0.5，P＜0.05）。
1.5.8 蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI）使用STRING 11.0 数据库（https：//string-db.org/）分析差异表达基因，最小有效结合分数为0.4。PPI 网络是用Cytoscape 3.6.1 软件构建的。CytoHubba 插件被用来寻找网络结构中的核心差异基因。
1.5.9 Western blot用含PMSF 和磷酸酶抑制剂的RIPA 提取PBMCs 总蛋白。SDS-PAGE 分离变性的蛋白质并将其转移到PVDF 膜上。5% BSA 封闭2 h，相应一抗4 ℃孵育过夜。二抗室温孵育。在成像系统下使用ECL 对所得印迹进行可视化。
1.5.10 RT-qPCR 检测转录基因采用Trizol 法提取细胞总RNA，按Takara 说明书合成cDNA 及PCR 体系，最后结果以2-ΔΔCt分析。Foxp3、RORγt、SMAD3、STAT3 及GAPDH 的引物序列，见表1。
表1 引物序列Tab.1 Primer sequences
1.6 统计学方法本实验统计分析用SPSS 26.0处理；
GraphPad 9.5 版进行相关绘图工作。数据以（）表示。多组间的平均值使用单因素方差分析，然后用Dunnet-t检验对各Co-culture 组和PBMC组之间进行分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2.1 UCMSCs 的形态和表面分子鉴定UCMSCs形态在显微镜下可见均匀分布，呈现出典型的纺锤形和涡旋状排列。见图1。
图1 UCMSCs 镜下形态（50 ×，200 ×）Fig.1 Morphology of UCMSCs under microphone（50×，200×）
流式细胞术分析UCMSCs 的表面标记，CD29、CD73、CD90 和CD105 为阳性，而CD31、CD34、CD45和HLA-DR 为阴性，几乎不表达。符合国际细胞协会MSC 标准。见图2。
图2 UCMSCs 细胞表面标记Fig.2 Facing marker of UCMSCs
2.2 UCMSCs 治疗对Th17/Treg 平衡的影响Coculture 组与PBMCs 组相比，Th17 细胞比例、Th17/Treg 值明显减少（P＜0.05），Co-culture 2 组Th17细胞比例显著降低（P＜0.001）；
Treg 细胞比例在Co-culture 2 组明显增加（P＜0.01）。见图3、4及表2。
图3 CD3+CD8-IL-17A+ Th17 细胞比例Fig.3 Frequency of CD3+CD8-IL-17A+ Th17 cells
图4 CD25+Foxp3+CD4+ Treg 细胞比例Fig.4 Frequency of CD25+Foxp3+CD4+ Treg cells
表2 不同组间Th17、Treg 及Th17/Treg 值Tab.2 Th17，Treg and Th17/Treg values among different groups ±s
表2 不同组间Th17、Treg 及Th17/Treg 值Tab.2 Th17，Treg and Th17/Treg values among different groups ±s
注：与PBMC 组相比，**P＜0.01，***P＜0.001
组别PBMC 组Co-culture 1 组Co-culture 2 组F 值P 值例数3 3 3 Th17（%）4.17 ± 0.35 3.05 ± 0.05**2.53 ± 0.25***33.21＜0.001 Treg（%）1.80 ± 0.10 2.13 ± 0.12 3.17 ± 0.51**15.94 0.004 Th17/Treg 2.31 ± 0.07 1.43 ± 0.06***0.81 ± 0.07***383.05＜0.001
2.3 UCMSCs 治疗对TGF-β1、IL-17 和IL-6 的影响与单纯PBMCs 组上清液相比，Co-culture 2 组促炎因子TGF-β1 显著升高（P＜0.01），IL-17、IL-6下降（P＜0.05）。见表3。
表3 不同组上清中的TGF-β1、IL-17 及IL-6 的表达水平Tab.3 TGF-β1，IL-17 and IL-6 expression in the supernatants in different groups ±s，pg/mL
表3 不同组上清中的TGF-β1、IL-17 及IL-6 的表达水平Tab.3 TGF-β1，IL-17 and IL-6 expression in the supernatants in different groups ±s，pg/mL
注：与PBMC 组相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
组别PBMC 组Co-culture 1 组Co-culture 2 组F 值P 值例数5 5 5 TGF-β1 3.73 ± 1.73 2.48 ± 1.97 9.84 ± 2.69**16.49＜0.001 IL-17 2.29 ± 1.29 0.78 ± 0.34 0.25 ± 0.18*5.55 0.043 IL-6 1 192.04 ± 65.48 1 029.57 ± 100.72*876.97 ± 82.78***17.49＜0.001
2.4 UCMSCs 治疗对RORγt 和Foxp3 的影响Western blot 和RT-PCR 检测Foxp3 和RORγt 的蛋白和基因表达水平，显示Foxp3 明显增加，RORγt明显下降（P＜0.05）。见图5。
图5 UCMSCs 治疗对RORγt 和Foxp3 的影响Fig.5 Effect of UCMSCs treatment on RORγt and Foxp3
2.5 转录组测序技术分析对照组和共培养组PBMCs 中的差异基因表达经UCMSCs 治疗后，较AIH 患者PBMCs 细胞出现93 个上调差异mRNA（FC ≥2，P＜0.05）；
95 个下调差异mRNA（FC ≤0.5，P＜0.05），本研究只富集前15 个表达量最高的mRNA 进行后续分析。见图6。
图6 差异基因mRNA 韦恩图Fig.6 Venn diagram of differential gene mRNA
2.6 转录组测序技术分析对照组和共培养组PBMCs 中的差异基因表达通过对UCMSCs 对PBMCs 的前15 组转录系主要作用通路进行统计学富集分析。发现差异mRNA 富集的变化集中在免疫应答、淋巴细胞分化/激活以及T 细胞的激活调整等领域。见图7。
图7 共有差异mRNA 富集图（前15 位）Fig.7 Total differential mRNA enrichment map（top 15）
2.7 PP 网络构建、关键转录基因筛选蛋白质互作网络（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）图显示Co-culture 组与PBMC 组相比，SMAD3 的表达量增加而STAT3 的表达量减少，并可见其表达占比高。见图8。
图8 AIH 差异表达基因编码蛋白网络互作图Fig.8 PPI of AIH differentially expressed genes encoding
2.8 UCMSCs 治疗促进STAT3 下调和SMAD3 上调结合上述结果，我们进一步论证SMAD3 和STAT3 的激活，以其磷酸化状态为标志。当UCMSCs：PBMCs 为1∶5 时，Western blot 结果显示STAT3 磷酸化（p-STAT3）明显下调（P＜0.01），p-SMAD3 则上调（P＜0.05）。一致的是，SMAD3 mRNA 水平在Co-culture 2 组中明显高于PBMC 组（P＜0.001），而STAT3 mRNA 水平减少（P＜0.001）。见图9。
图9 UCMSCs 治疗对STAT3 和SMAD3 的影响Fig.9 Effect of UCMSCs treatment on STAT3 and SMAD3
研究证实，UCMSCs 因其免疫调节特性可将适应性细胞从以效应性T 细胞（Th17 cells）为主的炎症环境调节到富含Tregs 的微环境。本研究结果显示，UCMSCs 与从AIH 患者外周血提取的PBMCs共培养时，UCMSCs 可促使Th17 细胞分化为Tregs，TGF-β1 释放增加，Th17/Treg 值下降，IL-17 和IL-6的释放显著减少，提示UCMSCs 治疗可逆转Th17/Tregs 免疫失衡，改善AIH 免疫微环境。Th17/Tregs免疫失衡在AIH 的发展中起着重要作用。临床研究［8］显示，AIH 患者的外周血中Th17 细胞的比例高于CD4+T 细胞，与肝损伤呈正相关关系。RORγt 是一种促进Th17 细胞分化的转录因子［9］。研究［10］表明，当低浓度的TGF-β1 与IL-6 同时存在时，能够通过激活STAT3 磷酸化诱导RORγt 表达，从而诱导CD4+T 细胞向Th17 细胞分化。Treg 对免疫介导的炎症反应有明显的负向调节作用，对维持免疫平衡和调节自身免疫反应至关重要。转录因子Foxp3 作为Treg 分化标志物，也是识别CD25+Foxp3+CD4+Treg 细胞的特异性标志物。进一步研究发现UCMSCs 治疗可上调Foxp3 表达，减少RORγt 表达。
为进一步探索UCMSCs 治疗AIH 免疫微环境的潜在作用机制，采用RNA 测序和生物信息分析研究主要作用通路，其中SMAD3 和STAT3 占据核心位置。再通过实验结果显示UCMSCs 治疗主要通过上调p-SMAD3，下调p-STAT3 来介导PBMCs中的Th17/Treg 免疫平衡。机制研究发现，转化生长因子β1（TGF-β1）［11］是维持免疫耐受的真正关键，通过启动TGF-β 信号通路在Tregs 和Th17 细胞的分化中起着关键作用。TGF-β1 可使下游的SMAD 蛋白磷酸化，诱导SMAD 蛋白在细胞核中聚集，并作为转录因子进行转录调节［12］。
综上，在大剂量UCMSCs 治疗后，可明显下调Th17/Treg 值，促进TGF-β1 含量，增强SMAD3 表达，诱导Treg 细胞的分化和增殖；
降低STAT3 表达，减少Th17 细胞的分化和生成。为临床试验的开展提供数据支持。