郑 晔, 黄秀玲, 冯 景, 朱俊俊, 华子恺
(上海大学机电工程与自动化学院, 上海 200444)
近年来, 随着老龄人口增多、骨关节疾病发病率逐年上升, 人工关节置换术需求也随之扩大. 人工膝关节置换术的10 a 存活率为90% 以上[1], 尽管如此, 仍有患者需要术后翻修. 随着人工关节置换术数量的不断增加, 失效的绝对数量仍然较大. 有文献报道, 70%的翻修手术是由无菌性松动引起的[2]. 磨损产生的磨屑在假体松动的发生发展过程中起着关键性作用[3].尤其是聚乙烯(polyethylene, PE) 磨屑, 数量多(70%∼90%), 分布广, 可以引起假体周围骨界面附近的生物学反应, 继发骨溶解并最终导致假体无菌性松动, 进而制约人工假体的使用寿命[4-8]. 因此, 研究人工关节假体材料及其磨屑尤为重要.
超高分子量聚乙烯(ultra high molecular weight polyethylene, UHMWPE) 磨屑已被大量研究, 并形成了标准分离提取方法——ISO 17853:2011. 随着人工关节材料的更新换代, 一种抗氧化、低磨损的维生素E 稳定型高交联聚乙烯(vitamin E stabilized highly cross-linked polyethylene, VE/HXLPE) 出现. VE/HXLPE 人工关节的磨损率明显低于UHMWPE[9], 但VE/HXLPE 磨屑同样存在无菌性松动和骨溶解风险. 此外, VE/HXLPE 磨屑是否可以用现有标准提取还未知, 且润滑介质降解后的取样量对磨屑表征影响尚无全面、系统的研究. 针对以上问题, 本工作将通过实验探究现有的磨屑提取方法是否适用于低磨损VE/HXLPE 膝关节磨屑, 并分析润滑介质降解后的消化液取样量对其磨屑数量、体积和形貌特征等的影响.
1.1 方案设计
基于ISO 17853:2011 标准, UHMWPE 磨屑的分离提取一般包括2 个步骤: 血清的消化和磨屑的收集. 消化血清的方法有盐酸消化法和NaOH 消化法, 其中酸消化法对血清蛋白清除效率较高、成本低、易操作, 是聚乙烯磨屑分离提取的首选方法.
采用酸消化法对润滑介质中的VE/HXLPE 膝关节磨屑进行提取, 标准方法的步骤如下:①将冷冻的固态小牛血清(内含磨屑) 从冰柜中取出, 刮掉表面沉积物后在常温下解冻10 h;②将血清均匀搅拌5 min 并量取10 mL, 使取样具有代表性; ③取40 mL 盐酸溶液(体积分数为37%) 与10 mL 血清混合, 50◦C 水浴恒温搅拌1 h, 得到浅紫色消化液; ④取0.5 mL 消化液加至100 mL 无水甲醇溶液中搅拌均匀, 通过0.05 µm 聚碳酸酯滤膜真空抽滤, 滤膜上的颗粒即为提取的磨屑.
图1 为不同取样量VE/HXLPE 磨屑的扫描电镜(scanning electron microscope, SEM)图. 可以看出:取样量0.5 mL 时提取的VE/HXLPE 膝关节磨屑在低倍和高倍SEM 图中均难以达到表征数量(见图1(a)). VE/HXLPE 人工膝关节磨损量低, 直接导致磨屑数量减少. 分析标准方法中与磨屑数量有关的参数可知, 消化液取样量直接影响呈现在滤膜上的磨屑数量.
图1 VE/HXLPE 磨屑SEM 图像Fig.1 SEM images of VE/HXLPE debris
研究磨屑群体可以克服磨屑研究的随机性, 能够更客观、全面反映人工关节磨损过程的演变规律. 我们推测消化液取样量的变化会影响磨屑的数量, 从而最终影响磨屑的表征. 因此, 将标准方法步骤④中的取样量新增4 组(1.0、2.0、4.0 和6.0 mL), 探究取样量对低磨损VE/HXLPE 人工膝关节磨屑数量、体积、形貌特征等的影响. 由图1(b) 可知, 若仅改变取样量为1.0 mL, SEM 图像中的磨屑数量明显增加.
1.2 实验方法
1.2.1 磨屑的制备、分离与提取
采用Orthotek 实验室的人工膝关节磨损试验机(型号JointWear-K4301), 以小牛血清为润滑介质, 根据ISO 14243-3 进行总循环次数为500 万次的金属股骨髁和VE/HXLPE 胫骨衬垫配副的人工膝关节步态体外磨损试验, 每50 万次循环使用450 mL 小牛血清, 在每50 万次结束后暂停设备回收小牛血清润滑介质(内含磨屑) 并及时放入冰箱冷冻保存, 直至达到总循环次数. 表1 为试验参数. 选取第450 万次∼第500 万次循环(此阶段处于稳定磨损状态)产生的磨屑进行分析. 试验结束后, 采用标准方法以不同取样量提取磨屑进行研究.
表1 试验参数Table 1 Test parameters
1.2.2 磨屑的观测与表征
裁剪带有磨屑的滤膜, 并用碳胶粘贴在铝块上. 为使磨屑具有导电性, 需要对滤膜进行喷金处理. 使用日本JEOL 公司的JSM-7500F 冷场发射扫描电子显微镜对磨屑进行观测, 放大倍数为5 000∼10 000 倍, 加速电压为5 keV, 每个样品均在视野范围内随机获取20 张清晰图像.
利用图像分析软件Image-Pro Plus 将磨屑从图像中分离, 得到磨屑的数量、最大直径dmax、最小直径dmin、周长P、长度L、宽度W、面积A (见图2), 并计算等效圆直径DEC、纵横比RA、延伸率E、圆度R 和形状因子FF等参数, 对磨屑尺寸、形状进行描述.
图2 磨屑参数Fig.2 Wear debris parameters
根据图像区域内的平均磨屑数量nm, 计算不同取样量下滤膜上的磨屑总数nT:
式中: SL为每张滤膜的有效过滤面积; SP有每张图像面积.
根据图像区域内的平均磨屑体积Vm, 计算不同取样量下滤膜上的磨屑总体积VT. 原子力显微镜观测到磨屑厚度h 可通过线性回归法确定为约等于磨屑等效圆直径DEC的1/3[10], 据此估算获得的磨屑体积:
式中: nP为图像数.
等效圆直径DEC是与磨屑投影面积相等的圆的直径, 是衡量磨屑尺寸的一个重要参数:
纵横比RA是描述磨屑形状的常用参数:
式中: dmax是磨屑轮廓上任意两点之间所能画出的最长直线距离; dmin是垂直于大直径的最长直线距离.
延伸率E 与RA类似, 更适用于描述长形磨屑, 尤其是纤维状磨屑:
圆度R 用来衡量磨屑与圆的相似程度,
形状因子FF与R 类似, 对磨屑轮廓的粗糙度变化更为敏感:
将统计到的VE/HXLPE 磨屑进行分析, 得出磨屑参数的频率分布图及箱型图, 再使用IBM SPSS Statistics 26 软件分析统计数据的显著差异性. 描述数据统计描述的表示形式为m±s (平均值± 标准差), 数据若符合正态分布且方差齐次, 则采用单因素方差分析(analysis of variance, ANOVA); 若不符合正态分布则采用曼-惠特尼-U 非参数检验. 检验水准设定α=0.05.
2.1 磨屑观测
图3 为不同取样量下提取的VE/HXLPE 人工膝关节磨屑的SEM 图像. 由图3 可以看出: 磨屑均呈白色不透明状; 放大5 000 倍时, 磨屑密度随着取样量的增加而增大, 并呈不规则的类球形、片状、棒状或丝状, 形状复杂且表面粗糙. 在0.5、1.0、2.0 mL 取样量下, 磨屑轮廓清晰且形状完整, 但在4.0、6.0 mL 取样量下, 磨屑出现团聚状态, 颗粒重叠、轮廓模糊, 干扰后续的计数与表征. 这可能是由于磨屑经抽滤方式沉降时, 过量磨屑重叠分布于滤膜. 图4 为团聚磨屑的SEM 图像. 可以看出: 4.0、6.0 mL 组的滤膜孔径模糊不清, 磨屑轮廓模糊且呈团聚态; 对于相互缠绕的纤维状磨屑, 其数量统计和形貌表征均受到严重影响.
图4 团聚磨屑的SEM 图像Fig.4 SEM image of agglomerated debris
SEM 图像模糊也可能是小牛血清中未消化的蛋白质所致. 蛋白质降解是磨屑提取的首要环节, 本实验采用酸消化法降解蛋白质. 强酸降解蛋白质操作简单、时间短、效率高, 但降解蛋白质的效率并非100%. 张涛[11]用50 mL 浓盐酸在60◦C 水浴中搅拌降解10 mL 的小牛血清溶液1 h, 结果显示溶液中蛋白质的消化率最高时为71.87%, 表明仍有部分蛋白质包覆于磨屑上. 图5 为未降解网状蛋白质包覆磨屑的SEM 图像. 可以看出, 磨屑边缘和滤膜的分界模糊, 导致SEM 图像上可统计的磨屑少. 因此, 本工作仅对取样量为0.5、1.0、2.0 mL 组别进行分析讨论.
2.2 磨屑鉴定
图6 为随机域中颗粒在滤波器上的X 射线能谱分析. 可以看出, 各组谱图均显示C 元素峰最明显, O 元素峰次之, 无明显的Co、Cr、Ti、Mo 元素峰. 表2 给出了随机域中颗粒不同元素的质量分数. 由表2 可知, C、O 元素的质量分数合计高达99%, Co、Cr、Ti、Mo 元素的质量分数合计不足1%. 本实验中关节配副材料为金属与聚乙烯, 能谱显示磨屑主要由非金属元素组成, 由此可判断分离提取的颗粒为聚乙烯磨屑(含C、H 元素). 质量分数最高的C 元素来自磨屑和滤膜(含C、H、O 元素), 而质量分数较高的O 元素可能来自滤膜.
表2 随机域中颗粒不同元素的质量分数Table 2_The mass fraction of different elements of the particle in the random domain%
图6 随机域中颗粒在滤波器上的能谱分析Fig.6 Energy spectrum analysis of particles on filters in the random domain
2.3 提取方法对磨屑数量的影响
VE/HXLPE 膝关节磨屑以不同取样量分离提取后, 对其SEM 图像进行磨屑计数统计,得到单位图像区域内磨屑数量的平均值与标准差(见表3).
表3 每张图像内VE/HXLPE 磨屑数量Table 3 The quantity of VE/HXLPE debris in each image
扫描电镜放大5 000 倍时, SP约为420.85 µm2(23.37 µm×17.78 µm), SL约为6 361.73 mm2(45 mm×45 mm×π). 将上述数据代入式(1), 计算不同取样量下提取到的磨屑总数, 并做组间差异性分析以确定磨屑数量分布是否存在显著性差异, 结果如图7 所示.
图7 过滤面积内的VE/HXLPE 磨屑数量Fig.7 The quantity of VE/HXLPE debris in the filtration area
由图7 可知, 磨屑数量随取样量的增加而增加, 但非严格按照取样量的倍增而倍增. 取样量0.5 mL 代表现有标准下VE/HXLPE 磨屑的提取数量, 与取样量1.0、2.0 mL 组之间均存在显著性差异(P < 0.05). 以图像中磨屑数量估计体外测试中小牛血清所含的全部磨屑数量,结果如图8 所示. 对比标准取样量0.5 mL 下的VE/HXLPE 磨屑提取数量, 取样量1.0 mL组的提取效率为115%, 2.0 mL 组的提取效率为117.5%.
图8 体外测试小牛血清中的VE/HXLPE 磨屑总数Fig.8 Total numbers of VE/HXLPE debris in calf serum was tested by vitro test
2.4 提取方法对磨屑体积的影响
VE/HXLPE 膝关节磨屑以不同取样量分离提取后, 对各取样量下的磨屑体积进行计算,得到每张图像区域内统计到的平均磨屑体积结果(见表4).
表4 图像内VE/HXLPE 磨屑平均体积Table 4 Average volume of VE/HXLPE debris in images
通过表4 中的数据计算小牛血清中的磨屑总体积,并与体外测试的人工膝关节磨损量对比.实验中VE/HXLPE 人工膝关节磨损量为(11.68±3.16)mg/Mc,材料密度为0.940 mg/mm3,可得磨损体积为(12.43±3.36) mm3/Mc. 根据式(2), 可计算每百万次循环后提取磨屑的总体积, 结果如图9 所示. 通过计算可知, 当取样量为0.5、1.0、2.0 mL 时, VE/HXLPE 磨屑的提取效率分别为66%、82%、93%.
图9 不同取样量下VE/HXLPE 磨屑的总体积Fig.9 Total volumes of VE/HXLPE debris
2.5 提取方法对磨屑形貌的影响
2.5.1 磨屑尺寸
图10 为本实验提取磨屑的等效圆直径DEC分布情况. 可以看出, VE/HXLPE 磨屑的尺寸分布范围广泛, DEC为0.1∼10.0 µm, 其中90% 以上为0.1∼1.0 µm, 小于1.0 µm 或大于10.0 µm 的磨屑较少, 这与文献[12] 中给出的磨屑尺寸范围一致. 由于小尺寸磨屑数量多, 大尺寸磨屑数量少, 磨屑尺寸与磨屑数量之间呈右偏峰态分布. 另外, 各取样量下的磨屑大多为0.1∼0.5 µm.
图10 VE/HXLPE 磨屑的DEC 分布Fig.10 DEC distribution of VE/HXLPE debris
磨屑尺寸是决定细胞活性的关键因素, 分布大多为微米级(>1.0 µm)、亚微米级(0.1∼1.0µm) 和纳米级(<100 nm). 0.1∼10 µm 的磨屑可刺激巨噬细胞吞噬, 引起炎症/细胞因子的产生, 从而导致骨溶解, 其中亚微米级磨屑(0.1∼1.0 µm) 的生物活性更高[13-15]. 临床上已发现较小的磨屑更易从植入部位移动扩散, 且临界尺寸为0.2∼0.8 µm 的磨屑更是引起生物反应的关键[16]. 表5 为不同取样量下VE/HXLPE 磨屑尺寸. 通过以上分析可知, 磨屑尺寸均在活性范围内, 故取样量对尺寸所决定的磨屑生物活性无明显影响.
表5 VE/HXLPE 磨屑尺寸Table 5 VE/HXLPE debris sizes
2.5.2 磨屑形状
磨屑的形状对细胞活性的影响不可忽视. 较多研究表明, 细长形磨屑比球形磨屑生物活性更活跃, 可刺激细胞分泌更高水平的炎症因子[17]. RA与E 均为表征磨屑形状是否为细长形的参数, 值从1 开始, 值越大代表磨屑形状越偏细长, 生物活性也越高. 图11 为各取样量下磨屑形状参数RA、E、R、FF的箱型图. 表6 为磨屑各形状参数的平均值. 由图11 和表6 可知,0.5 mL 下VE/HXLPE 磨屑的RA和E 平均值最大, 2.0 mL 组磨屑的RA和E 平均值较大.根据RA将磨屑分为类球状和纤维状, 若RA>2, 则磨屑为纤维条状(包含条状、棒状及部分片块状颗粒); 若RA≤2, 则磨屑为类球状[18]. 根据上述分类, 本工作中, 0.5 mL 组纤维条状磨屑占比10.71%, 而2.0 mL 组纤维条状磨屑占比11.60%.
表6 VE/HXLPE 磨屑形状参数的平均值Table 6 Average values of shape parameters of VE/HXLPE debris
图11 VE/HXLPE 磨屑形状参数Fig.11 Shape parameters of VE/HXLPE debris
R 与FF是衡量磨屑形状与圆的相似程度, 值为0∼1. R 与FF的值越接近1 表示磨屑形状越偏向圆形, 其生物活性也越低; 而值越接近0, 磨屑的生物活性越高. 由图11 和表6可知, VE/HXLPE 磨屑在取样量2.0 mL 的R 和FF平均值分布与0.5 mL 组无显著性差异(P >0.05), 而与1.0 mL 组存在显著性差异(P <0.05).
本工作通过实验探究了现行磨屑提取方法是否适用于低磨损VE/HXLPE 膝关节磨屑,同时分析了消化液取样量对提取磨屑各表征参数的重要影响. 结果表明: 改变磨屑提取方法中的取样量会影响提取的磨屑数量、体积及形貌分布. 采用现行标准可提取到的VE/HXLPE 磨屑数量较少, 难以达到表征数量, 增大消化液取样量能够提取到更多的低磨损VE/HXLPE 膝关节磨屑, 更全面地表征磨屑群体, 为VE/HXLPE 人工膝关节产品应用提供更全面有价值的参考.
猜你喜欢磨屑滤膜形状维生素E稳定型高交联聚乙烯人工关节磨损及磨屑的研究进展北京生物医学工程(2022年6期)2022-12-24挖藕 假如悲伤有形状……中学生天地(A版)(2022年11期)2022-11-25磨屑对TC4钛合金微动磨损行为的影响摩擦学学报(2022年5期)2022-10-11人工关节CoCrMo-UHMWPE 配副在不同接触应力下的摩擦、磨损和磨屑特征材料保护(2022年12期)2022-02-16溶胶-凝胶法制备高性能ZrO2纳滤膜陶瓷学报(2020年3期)2020-10-27A case report of acupuncture of dysphagia caused by herpes zoster virus infectionClinical Research Communications(2019年1期)2019-04-23刹车片磨屑形貌及物相分析*材料研究与应用(2019年1期)2019-04-01你的形状新世纪智能(英语备考)(2018年11期)2018-12-29看到的是什么形状小学生学习指导(低年级)(2016年10期)2016-12-01荷负电手性壳聚糖纳复合滤膜的制备与性能研究应用化工(2014年1期)2014-08-16