涂韵之,傅 芬,陈秋连
(1.新余市人民医院妇产科,江西 新余 338000; 2.南昌大学第二附属医院妇产科,南昌 330006)
宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,指的是起源于子宫颈的恶性肿瘤。在女性恶性肿瘤中,宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌,占女性生殖系统恶性肿瘤发病率的75%～90%左右[1]。在我国,宫颈癌的发病率和病死率呈上升趋势,特别是在欠发达国家,宫颈癌的发病率和病死率均高于发达国家[2-3]。目前,宫颈癌的临床治疗主要采用手术、放疗、化疗等综合治疗方式,其中化疗主要以铂类药物为主[4]。尽管目前的治疗方法一定程度上改善了患者的生存率,但仍存在术后复发和耐药性等问题,因此寻找有效治疗宫颈癌的方法和手段仍是当前临床面临的难题。
钙黏蛋白(cadherin,CDH)是一种跨膜糖蛋白,位于细胞表面,对细胞间的黏附功能发挥着重要作用。其中CDH3是钙黏蛋白家族的一员[5]。有研究[6]表明,CDH3在癌症发展中具有双向作用。例如,在胃癌、胰腺癌和乳腺癌等肿瘤中,CDH3可以促进癌细胞的生长和扩散,而在肝细胞癌、非小细胞肺癌和黑色素瘤中,CDH3则抑制了肿瘤的发生。目前还没有文献报道CDH3在宫颈癌中的作用机制。
磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(protein serine threonine kinase,Akt)信号通路是促进存活、抗凋亡的经典信号传递途径,与肿瘤的发生、发展以及放疗抵抗密切相关,是近年来肿瘤分子生物学研究的热点领域[7]。有研究[8-9]表明,PI3K/Akt信号传递通路在多种人类恶性肿瘤中异常活化,如宫颈癌、卵巢癌和胰腺癌等。本研究旨在探究CDH3基因表达变化对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及是否通过调节PI3K/Akt信号通路来发挥作用。这将为揭示宫颈癌的分子机制和临床治疗提供新的实验依据。
1.1 数据及样本来源
从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获取宫颈癌患者的基因表达和相关临床数据。
从2019年至2021年间于江西省新余市人民医院妇产科接受治疗的10例宫颈癌患者手术中获取活检样本(宫颈癌及癌旁组织)。样本清洗后放入编号的离心管中,于液氮罐中储存。人宫颈癌HeLa和C33A细胞系均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,进行常规传代培养。
1.2 基因差异表达、生存和KEGG通路分析
使用R软件的“limma”包对宫颈癌患者的CDH家族基因的表达数据进行贝叶斯差异分析,得到差异表达基因,通过R软件的“ggplot2”包绘制基因表达情况的箱式图。将表达上调的CDH基因与生存相关的基因取交集,通过Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com),用best cutoff算法分析交集基因表达对患者总生存期(OS)的影响。根据交集基因表达的中位数将宫颈癌患者分为高表达组和低表达组,通过R软件的“CluserProfiler”包对筛选出的基因进行KEGG通路分析。
1.3 qPCR
用Trizol试剂提取样本总RNA。使用TransScript®Uni All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR反转录试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)合成cDNA。使用PerfectStart®Green qPCR SuperMix试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)进行qPCR。目的基因引物序列为CDH3-F:5′-CAGGTGCTGAACATCACGGACA-3′;CDH3-R:5′-CTTCAGGGACAAGACCACTGTG-3′。内参基因引物序列为GAPDH-F:5′-TCCACTGGCGTCTTCACC-3′;GAPDH-R:5′-GGCAGAGATGATGACCCTTTT-3′。
1.4 细胞培养和转染
人宫颈癌HeLa和C33A细胞系均购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心,均培养于添加了10%胎牛血清的Eagle最低必需培养基(北京普迈精医科技有限公司)中,在37 ℃、5% CO2条件下培养。
构建sh-CDH3#1、sh-CDH3#2质粒转染细胞,干扰CDH3表达;构建CDH3-OE质粒转染细胞,增强CDH3表达;用sh-NC空载质粒转染细胞,作为对照。
1.5 CCK8细胞增殖实验
将转染了sh-NC、sh-CDH3#1和sh-CDH3#2质粒的细胞以相同的密度接种到新培养孔,培养0、1、2、3、4 d后加入CCK8工作液(CCK8溶液：培养基=1：10),37 ℃培养箱中孵育3 h后,测定450 nm 处的吸光值。
1.6 Transwell检测细胞迁移、侵袭
将转染了sh-NC、sh-CDH3#1和sh-CDH3#2质粒的细胞接种到含有RPMI1640培养基(2%胎牛血清)的Transwell上室中,下室中加入胎牛血清浓度为20%的培养基。培养24 h后,加入4%多聚甲醛固定细胞15 min。擦去膜上侧细胞,下侧细胞用1%结晶紫溶液染色,用PBS洗去染色液后在显微镜下拍照分析细胞迁移。
侵袭实验方法与迁移实验基本相同,接种细胞前在Transwell上室中加入100 μL浓度为1 mg·mL-1的Matrigel,37 ℃孵育3～5 h使其凝固。
1.7 Western blot检测
在转染72 h收获细胞,通过10% SDS/PAGE分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封闭后,将膜在4 ℃下与一抗孵育过夜。洗膜后,再次将蛋白与二抗在室温下孵育1 h,再次洗膜。最后,使用ChemiDocTMXRS显影系统(美国Bio-Rad公司)检测目标蛋白。
1.8 统计学方法
2.1 CDH家族基因在宫颈癌患者中的表达情况
共从TCGA数据库获取547例宫颈癌患者和35例健康女性的基因表达数据,分析结果显示CDH15、CDH18、CDH24和CDH3在宫颈癌患者中表达上调,CDH11、CDH4、CDH23、CDH5、CDH19、CDH12、CDH22、CDH8和CDH2表达下调(图1)。把差异上调的CDH基因和生存相关的CDH基因取交集,得到2个基因:CDH3和CDH18(图2)。而CDH3的表达量显著高于CDH18(图3),因此选择CDH3作为目的基因进行后续实验。
图1 CDH家族基因在宫颈癌患者中的表达火山图
图2 表达上调与生存相关的CDH基因的韦恩图 图3 差异表达上调基因的表达量箱式图
2.2 CDH3表达对宫颈癌患者OS的影响
生存分析结果显示,与CDH3低表达组相比,CDH3高表达组患者的预后生存情况显著较差(P=0.029)。见图4。
2.3 CDH3在宫颈癌组织中高表达
qPCR结果显示,宫颈癌组织中的CDH3表达水平显著高于对应的癌旁组织(P<0.000 1)。见图5。
2.4 CDH3敲低抑制宫颈癌细胞增殖
CCK8细胞增殖实验结果显示,HeLa和C33A的sh-CDH3#1组和sh-CDH3#2组的增殖能力均显著低于NC组(P<0.01或P<0.001),CDH3敲低明显降低了宫颈癌细胞的增殖能力。见图6。
2.5 CDH3敲低对宫颈癌细胞迁移、侵袭能力的影响
Transwell迁移实验结果显示,与sh-NC组相比,sh-CDH3#1和sh-CDH3#2组的HeLa和C33A细胞的迁移能力显著降低(P<0.001或P<0.000 1,图7A)。侵袭实验结果显示,sh-CDH3#1和sh-CDH3#2组细胞侵袭能力较sh-NC组显著降低(P<0.001或P<0.000 1,图7B)。以上结果表明,敲低CDH3基因会抑制宫颈癌细胞的迁移和侵袭能力。
A:敲低CDH3降低HeLa和C33A细胞的迁移能力;B:敲低CDH3降低HeLa和C33A细胞的侵袭能力。*P<0.001,**P<0.000 1。
2.6 CDH3通过PI3K/AKT通路影响宫颈癌细胞活动
KEGG分析结果显示,CDH3在PI3K/AKT通路显著富集(图8A),提示CDH3通过调控PI3K/AKT通路影响宫颈癌细胞活动。Western blot实验结果验证了KEGG分析的结论:与NC组相比,sh-CDH3组CDH3表达水平降低,CDH3-OE组CDH3表达水平增加,表明HeLa和C33A细胞转染均有效(图8B);与NC组相比,shCDH3组P-PI3K和P-AKT表达量降低,PI3K和AKT表达无明显变化,而CDH3-OE组P-PI3K和P-AKT表达量升高,PI3K和AKT表达无明显变化(图8C)。上述结果表明CDH3通过促进PI3K和AKT的磷酸化调控PI3K/AKT通路,进而影响宫颈癌细胞的活动。
A:CDH3的KEGG通路分析;B:CDH3敲低和过表达后,HeLa和C33A细胞中CDH3的表达水平;C:CDH3的敲低和过表达对PI3K/AKT通路相关蛋白的影响。
宫颈癌是一种高发病率的癌症,其中人乳头瘤病毒是主要致病因素。尽管宫颈癌的治疗已经在多个方面取得了突破性进展,但大多数患者的预后仍然不理想,治疗方案常常存在严重的副作用[10]。因此,探究影响宫颈癌预后的因素和机制显得十分必要。CDH3属于钙素家族的一员,最初于1986年由国外学者NOSE等在小鼠胚胎发育中发现。该家族是一类重要的细胞间黏附分子,参与细胞极性和细胞分化的调节,有助于维持组织内的稳态[11-13]。在人类正常组织中,只有胸腺和胎儿大脑中检测到CDH3的低表达水平,然而在多种人类肿瘤组织中检测到CDH3高表达[14]。已有研究[15]明确表明,CDH3参与胚胎发育和成体组织结构中细胞内稳态的维持过程,对细胞分化、形态、极性、生长和迁移等过程具有重要意义。
本研究通过差异表达分析发现,CDH3和CDH18是与宫颈癌患者生存相关的2个基因。尽管这两个基因都与生存相关,但CDH3的表达量更高,因此可以考虑CDH3对宫颈癌生存影响更大。此前的研究表明,CDH3在高分化胃癌组织中高表达,并被认为是胃癌患者预后的一个标志物[16-17]。本研究的预后生存分析也显示,CDH3高表达组的患者预后明显更差(P=0.029),这进一步证实了CDH3的表达差异会影响患者预后。因此,笔者收集了宫颈癌临床患者的10对癌及癌旁组织,并检测了CDH3的基因表达水平。结果显示,CDH3在宫颈癌组织中的表达量显著高于癌旁组织,这与笔者的生信分析结果一致。此外,其他研究[18-19]也表明CDH3在结直肠癌组织和患者血浆中高表达,并且CDH3的过表达会促进多种癌细胞的迁移和侵袭[20-21],包括胰腺导管癌[22]。针对CDH3在宫颈癌中的作用,本研究细胞实验显示,敲低CDH3表达可以抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭。这些结果表明CDH3在宫颈癌中具有促进癌细胞发生和发展的作用。因此,CDH3有望成为宫颈癌诊断和治疗的重要靶点。
PI3K/Akt信号通路参与调控细胞周期的各个进程,促进肿瘤的发生发展,并且在肿瘤侵袭转移过程中扮演重要角色[23]。当PI3K受到上游信号(如生长因子)等刺激后,能够激活Akt。激活的Akt会进一步激活下游信号分子,发挥对肿瘤细胞多生物学活性的调控作用[24]。根据CDH3的表达中位数将患者分为高表达和低表达组,进行KEGG通路分析,发现CDH3与PI3K/Akt信号通路密切相关。随后,笔者通过Western blot实验证实,敲低CDH3后,P-PI3K和P-AKT表达量降低。过表达CDH3后,P-PI3K和P-AKT表达量升高。这些结果说明CDH3的表达变化会影响PI3K/Akt信号通路的激活。
本研究证实CDH3在宫颈癌组织中显著高表达,并且与患者不良预后相关。通过细胞实验证实CDH3在宫颈癌细胞中高表达,敲低CDH3表达会抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭,这种调控作用与PI3K/Akt信号通路的激活有关。这些发现可能为未来的宫颈癌临床治疗提供重要的理论基础。然而,CDH3的具体作用机制尚不明确,需要进一步探索和验证。
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