周家建,王学永,柴洪燕,刘 璇,马新越,赵约翰
(1. 潍坊医学院临床医学院,山东 潍坊 261042;2. 潍坊市潍城区人民医院,山东 潍坊 261000;3. 潍坊市人民医院,山东 潍坊 261041)
抑郁症是一种严重的精神疾病,近年来其发病率显著升高,大约影响全球20%的人口［1］。世界卫生组织预计,2030年抑郁症将会成为人类丧失工作能力和死亡的最主要原因［2-3］。抑郁症的病因尚不完全清楚,既往研究认为单胺类神经递质紊乱、下丘脑-垂体-肾上腺轴功能紊乱、神经营养因子缺乏等均与之有关,近年来对抑郁症的研究提出“细胞因子假说”,认为炎症过程和脑-免疫相互作用与抑郁症的发病密切相关［4-6］。脑源性神经营养因子(BDNF)是一种对轴突的生长、神经元的存活和突触的可塑性具有至关重要作用的神经营养肽,参与抑郁症的发病［7］。有证据表明,炎症因子能降低机体BDNF水平,炎症因子和BDNF在抑郁症中起重要作用［8-9］。银杏叶提取物EGb761具有抗炎、抗氧化、抗动脉硬化和神经保护作用,可预防记忆减退和中枢神经系统疾病的发生,改善情绪和认知功能［10-11］,但其是否具有抗抑郁作用及是否对脂多糖(LPS)诱导的抑郁模型具有抗抑郁样作用还未可知。本研究通过单次腹腔注射LPS制备急性抑郁样小鼠模型,观察EGb761预处理对小鼠行为学和海马组织中炎性细胞因子、BDNF表达的影响,旨在探讨EGb761抗抑郁作用及其机制,为银杏叶提取物用于抑郁症的治疗提供理论依据。
1.1实验动物 雄性C57BL/6J小鼠40只,8周龄,体重20～25 g,购自上海斯莱克实验动物有限公司,许可证号:SCXK(沪)2012-0002。实验开始前7 d适应新的实验环境,小鼠自由饮食摄水,实验遵循国家《实验动物管理条例》的动物饲养及实验要求。
1.2主要试剂 EGb761(金纳多片,德国威玛舒培博士药厂,规格:20 mg/片);LPS(美国Sigma公司);小鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-17A(IL-17A)、白细胞介素-10(IL-10)ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司);BDNF ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。
1.3主要仪器 ZH-ZFT型联合旷场实验视频分析系统、ZH-QPT型强迫游泳实验视频分析系统、ZH-XWT型悬尾实验视频分析系统(安徽正华生物仪器设备有限公司);iMark酶标仪(美国BIO-RAD公司)。
1.4实验方法 将40只小鼠随机分为对照组、模型组、EGb761低剂量组、EGb761中剂量组和EGb761高剂量组,每组8只。EGb761低、中、高剂量组小鼠分别给予EGb761(生理盐水溶解)50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)、150 mg/(kg·d)灌胃12 d,于第10天腹腔注射LPS 0.83 mg/kg(该剂量可引起疾病的急性反应和随后的抑郁样行为);模型组小鼠给予EGb761等量的生理盐水灌胃12 d,于第10天腹腔注射LPS 0.83 mg/kg;对照组小鼠给予EGb761等量的生理盐水灌胃12 d,于第10天腹腔注射等量的生理盐水。
1.5检测指标及方法
1.5.1旷场实验 腹腔注射LPS 24 h后,选用长100 cm、宽100 cm、高50 cm,周壁为黑色,地面为白色的敞箱进行旷场实验,评估小鼠的自发活动。敞箱地面用黑线划分为面积相等的25块,敞箱中央上方悬挂一只100 W的灯泡,在黑暗、安静的房间中进行实验。实验开始时,将小鼠置于清洁敞箱中央,录制实验小鼠的活动,使用ZH-ZFT型联合旷场实验视频分析系统分析并记录小鼠的水平运动得分(穿过地面的方块数)和垂直得分(站立次数),每只小鼠观察时间为5 min。为避免前一只小鼠的残留信息影响其他小鼠的测试结果,在新的实验开始前用75%的酒精清洗敞箱周璧及地面。
1.5.2强迫游泳实验 腹腔注射LPS 24 h后,选用直径12 cm、高40 cm的透明圆桶于夜间进行强迫游泳实验。桶内水深10 cm,水温保持(24±1)℃。实验第1天小鼠强迫游泳15 min,取出后于25 ℃温室烘干归笼;第2天,小鼠强迫游泳6 min,第2分钟开始使用ZH-QPT型强迫游泳实验视频分析系统记录分析后续4 min内小鼠的不动时间。实验结束后,将小鼠迅速取出,于25 ℃温室烘干归笼。为避免前一只小鼠的残留信息影响其他小鼠的测试结果,在新的实验开始前更换实验桶中的水。
1.5.3悬尾实验 腹腔注射LPS 24 h后,使用夹子夹住小鼠尾部距末端约3 cm处并倒吊于距地面30 cm左右的横杆上,实验总时长为6 min,第2分钟开始使用ZH-XWT型悬尾实验视频分析系统记录并分析后续 5 min内小鼠的不动时间。实验结束后,轻取小鼠并归笼。为避免前一只小鼠的残留信息影响其他小鼠的测试结果,在新的实验开始前对试验场所进行通风消毒。
1.5.4蔗糖水实验 实验分为训练实验和正式实验两部分,实验在隔噪音、安静的房间中进行。正式实验开始前48 h对实验小鼠进行蔗糖水饮用训练,每笼放置2个水瓶,第一个24 h,两瓶均为1%的蔗糖水100 mL;第二个24 h,1瓶为1%蔗糖水100 mL,1瓶为纯净水100 mL。腹腔注射LPS 24 h并禁水(24 h)后,开始进行糖水及纯水消耗实验,每笼放置2个水瓶(1%蔗糖水和纯净水各100 mL)。4 h后,测定小鼠的蔗糖水和纯水消耗量,计算蔗糖水偏爱率。蔗糖水偏爱率=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)×100%。
1.5.5海马组织中炎性因子和BDNF含量检测 小鼠腹腔注射LPS 48 h后,断头取脑组织,置于冰上剥离海马并称重,充分漂洗海马组织后加入定量的PBS制备海马组织匀浆,于-20 ℃条件下进行冻融循环破坏细胞膜,取匀浆液,4 ℃下5 000× g离心15 min,取上清液分装并保存在-20 ℃。按照ELISA试剂盒内的说明书测定海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A、IL-10和BDNF含量。
1.6统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,计量资料均符合正态分布,各组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1各组小鼠自发活动得分比较 模型组和EGb761各组小鼠的垂直得分、水平得分均明显低于对照组(P均<0.05),模型组和EGb761各组间垂直得分、水平得分比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。
图1 对照组和急性抑郁样各组小鼠自发活动垂直得分和水平得分
2.2各组小鼠强迫游泳不动时间和悬尾不动时间比较 模型组小鼠的强迫游泳不动时间和悬尾不动时间均明显长于对照组(P均<0.05),EGb761中、高剂量组小鼠的强迫游泳不动时间和悬尾不动时间均明显短于模型组(P均<0.05),且随EGb761剂量增加而逐渐缩短。见图2。
图2 对照组和急性抑郁样各组小鼠强迫游泳不动时间和悬尾不动时间
2.3各组小鼠蔗糖水偏爱率比较 模型组小鼠的蔗糖水偏爱率明显低于对照组(P<0.05);EGb761中、高剂量组小鼠的蔗糖水偏爱率均明显高于模型组(P均<0.05),且EGb761高剂量组明显高于EGb761低剂量组(P<0.05)。见图3。
图3 对照组和急性抑郁样各组小鼠蔗糖水偏爱率
2.4各组小鼠海马组织中炎症细胞因子含量比较模型组小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量均明显高于对照组(P均<0.05),IL-10 含量均明显低于对照组(P<0.05)。EGb761中、高剂量组小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量均明显低于模型组(P均<0.05),且EGb761高剂量组各指标含量均明显低于EGb761低、中剂量组(P均<0.05);EGb761中、高剂量组小鼠海马组织中IL-10 含量均明显高于模型组(P均<0.05),且EGb761高剂量组均明显高于EGb761低、中剂量组(P均<0.05)。见图4。
图4 对照组和急性抑郁样各组小鼠海马组织中炎性细胞因子含量
2.5各组小鼠海马组织中BDNF含量比较 模型组小鼠海马组织中BDNF含量明显低于对照组(P<0.05);EGb761中、高剂量组小鼠海马组织中BDNF含量均明显高于模型组(P均<0.05),且EGb761高剂量组均明显高于EGb761低、中剂量组(P均<0.05)。见图5。
图5 对照组和急性抑郁样各组小鼠海马组织中BDNF含量
LPS诱导模型是公认的炎症相关的抑郁症动物模型［12］。本实验采用该方法构建抑郁模型,结果显示模型组小鼠强迫游泳不动时间和悬尾不动时间显著延长,对蔗糖水偏爱率降低,证实LPS腹腔注射诱导小鼠的急性抑郁样行为模型成功;EGb761各剂量组与模型组相比,小鼠强迫游泳不动时间和悬尾不动时间随EGb761暴露剂量增加而缩短,蔗糖水偏爱率升高,表明EGb761能改善LPS诱导的小鼠快感缺乏。Rojas等［13］研究表明,EGb761能够缩短BALB/c小鼠强迫游泳不动时间,本研究结果与之具有一致性。另外人们普遍认为自发活动的改善可以缩短强迫游泳不动时间和悬尾不动时间,但本研究旷场实验结果显示,模型组和EGb761各组间小鼠的垂直得分和水平得分比较均无明显差异,因此推断强迫游泳不动时间和悬尾不动时间的缩短不是由自发活动改善所致,而是由EGb761抗抑郁作用所介导。
抑郁症可激活免疫系统,促进细胞因子的分泌,而细胞因子也能够改变个体的情绪和行为。抑郁症促炎性细胞因子与抗炎性细胞因子的激活是共同发生的,促炎性细胞因子如IL-1、IL-6 、TNF-α等参与免疫激活和炎症的发生［14］,而抗炎性细胞因子如IL-10等通过平衡促炎细胞因子的表达来影响抑郁行为［15］。Wu等［16］研究报道,抑郁症患者血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量显著升高。Ogodek［17］研究表明,抑郁症患者的血清IL-1β、IL-4、IL-8水平随着抑郁症的加重而增高,而血清IL-10水平明显降低。Pan等［18］认为IL-10可以逆转强迫游泳应激诱导的抑郁样行为。Kim等［19］研究报道,IL-17在抑郁症的发病机制中扮演重要角色,累积的轻度应激可通过上调IL-17导致抑郁症状的持续存在。本研究发现,腹腔注射LPS可诱导小鼠海马组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量升高和IL-10含量降低,与文献［13］报道相一致;预先给予中剂量和高剂量EGb761均可显著抑制小鼠海马组织中IL-10含量的降低以及TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A含量的升高。表明EGb761预处理可抑制炎症并激活抗炎反应,促使机体免疫系统恢复平衡。
抑郁症患者血清BDNF水平较正常人群显著下降［20］,而外周血与中枢系统中的BDNF 表达水平密切相关,提示抑郁样行为在本质上与大脑 BDNF表达有关［21］。中枢给予BDNF可在小鼠抑郁模型中产生抗抑郁样活性,说明BDNF对抑郁症具有保护作用［8］。本研究发现,腹腔注射LPS可诱导小鼠海马组织中BDNF含量降低,而中剂量和高剂量EGb761预处理可显著抑制海马组织中BDNF的降低。因此认为上调小鼠海马组织中BDNF含量可能会改善LPS诱导的小鼠抑郁样行为。
综上所述,EGb761能明显改善LPS诱导的小鼠急性抑郁样行为,其可能是通过抑制TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A产生,上调海马组织中BDNF及IL-10含量实现的。
利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。
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