刘逸超 郭 滢 季小彬 隋 鑫
（1 哈尔滨工业大学医院，黑龙江 哈尔滨 150001；
2 黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；
3 黑龙江省哈尔滨市阿城区舍利街卫生院，黑龙江 哈尔滨 150300；
4 哈尔滨市阿城区人民医院，黑龙江 哈尔滨 150300）
多囊卵巢综合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）多见于育龄期女性，生殖障碍、代谢紊乱、内分泌异常是其主要特征，月经周期不规律、不孕、多毛或痤疮是其主要临床表现，是最常见的女性内分泌疾病[1-2]，PCOS是子宫内膜癌的重要危险因素，其病理和机制以及临床意义尚不清楚[3-4]。c-Fos/MAPK信号通路在胚胎的发育过程中对细胞的生长、分化及增殖起到促进作用[5-6]，研究表明在子宫内膜癌中c-Fos的表达参与了肿瘤浸润T细胞的活化，同时研究表明子宫内膜癌中MAPK-ERK介导AMF/PGI信号传导干预肿瘤的发生[7-8]，但c-Fos/MAPK是否可以通过调控细胞周期干预子宫内膜癌进展尚不清楚。有研究表明，细胞周期调控因子cyclinD1可以通过诱导凋亡、细胞周期阻滞、抑制细胞迁移、侵袭和STAT3信号通路干预人子宫内膜癌细胞的生长，并且CyclinD1在子宫内膜样腺癌中的表达也具有显著变化[9]。
1.1 材料 2017年1月至2022年1月哈尔滨市阿城区人民医院妇科收集的28例PCOS并发子宫内膜癌患者子宫内膜癌组织作为试验组，以及功能失调性子宫出血患者部分子宫内膜组织作为对照组。入选该试验患者了解试验的全部流程，主动加入该项试验；
该项试验得到阿城区人民医院伦理委员会的批准。人子宫内膜癌细胞株HEC1B和Hela购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.2 主要试剂及仪器 高糖培养基DMEM（来自于美国corning公司）、胎牛血清和青链霉素（厂家：澳大利亚Ausbian公司）、细胞培养皿与离心管（生产单位：美国Corning公司）；
使用广州Ribobio公司生产的miR-637质粒及NC质粒进行试验；
引物厂家来自于生工生物工程（上海）股份有限公司；
CCK-8细胞活力/毒性检测试剂盒（生产单位：上海尚宝生物科技有限公司）；
凋亡试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；
c1000 qPCR仪及Western blot电泳仪的生产厂家均来自于美国Bio-Rad公司。
1.3 方法
1.3.1 qPCR检测组织及细胞中mRNA表达 对组织在液氮中进行研磨，细胞直接采用1 mL Trizol裂解，提取总mRNA。采用cDNA Synthesis Kit试剂盒逆转录试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix Kit PCR试剂盒进行逆转录处理，注意每项操作必须在冰面上进行，严格坚持无菌原则，防止污染RNA酶。荧光定量PCR检测的实施原则为：在95 ℃条件下进行预变性处理，时间设为10 min；
在95 ℃条件下进行变性处理，时间设为10 s；
在60 ℃条件下退火，时间设为30 s；
在72 ℃条件下进行延伸，时间为20 s。总共40个循环，使用GAPDH作为内参，以2-△△Ct计算mRNA相对表达量。见表1。
表1 引物序列
1.3.2 细胞培养及转染条件 HEC1B和Hela培养：取DMEM培养液（包含10%胎牛血清，100 μg/mL的青霉素，100 μg/mL 的链霉素），置CO2培养箱内，5%CO2，37 ℃静置培养；
抑制剂组细胞在培养基中加入20 μmol/L的MAPK抑制剂SBS03580进行培养，对照组正常培养。
1.3.3 CCK8法检测人子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞活力 使用CCK-8法检测人子宫内膜癌细胞活性，根据CCK8试剂盒说明书开展每项操作，将对照组细胞与转染24 h后的细胞接种到96孔板上，细胞密度设为2×103，将96孔板的温度设为37 ℃后培养细胞，培养时间设为24 h；
培养结束后，取10 μL CCK-8溶液分别滴入96孔板上，在溶液滴入孔板时不要产生气泡，以免影响OD值的读取；
将培养板放在培养箱内进行孵育，时间设为1～4 h，然后使用酶标仪测量在450 nm处的吸光度。
1.3.4 流式检测细胞凋亡实验 用不含EDTA的胰酶消化状态良好的HEC1B和Hela细胞后，300 g，在温度4 ℃的条件下进行离心处理，离心时间设为5 min，采集各组的子宫内膜癌细胞。使用PBS反复冲洗癌细胞2次，每次均需300 g，然后在温度4 ℃的环境里进行离心分离，离心时间控制在5 min。采集（1～5）×105细胞后吸弃PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer重悬。在凋亡细胞试剂内添加5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI Staining Solution，轻轻晃动试剂确保液体混合均匀。在避光、室温条件下，孵育试剂，孵育时间设为15 min。完成孵育后，取400 μL 1×Binding Buffer滴入试剂内，轻微摇晃试剂确保液体混合均匀并放在冰面上，所有样品在1 h内用流式细胞仪检测。
1.3.5 流式细胞周期实验 将各组状态良好的HEC1B和Hela细胞消化，吹打均匀，800 rpm离心5 min，收集细胞沉淀，弃上清，用预冷PBS洗涤2次，加入预冷75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上。1 500 rpm离心5 min，弃上清，以3 mL的PBS洗涤1次，加入400 μL的CCAA溶液（PI染液，50 μg/mL，engreen），100 μL的RNaseA（100 μg/mL），4 ℃避光孵育30 min。用流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件ModFit进行分析。
1.4 统计学处理 统计患者的相关指标数据，使用SPSS 23.0软件进行分析。计量资料使用（）表示，细胞活力与各时点使用重复测量的方差分析；
两组间比较符合正态分布并且满足方差齐性的使用双尾独立样本t检验；
计数资料采用χ2检验，P＜0.05表示数据差异存在统计学意义。
2.1 内膜组织c-Fos和MAPK的mRNA表达水平比较 相比于对照组，试验组MAPK和c-Fos均显著高表达，差异有显著的统计学意义（P＜0.05）。见图1。
图1 p38-MAPK和c-Fos mRNA在内膜组织中表达比较（与对照组相比，aP＜0.01）
2.2 各组子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞活力的比较 通过CCK8实验分析各组细胞活力，与对照组相比，抑制剂组子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞活力明显更低，在24 h吸光度、48 h吸光度及72 h吸光度方面，抑制剂组明显低于对照组，对比差异较大（P＜0.05）。见表2。
表2 各组子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞活力的比较
2.3 子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞凋亡水平的比较 通过流式细胞实验分析各组细胞存活和凋亡水平，与对照组相比，抑制剂组细胞存活比例明显更低，细胞早期凋亡比例、晚期凋亡比例明显更高，对比差异显著（P＜0.05）。见表3。
表3 各组子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞凋亡的比较（%，）
表3 各组子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞凋亡的比较（%，）
注：与对照组相比，aP＜0.05。
2.4 各组子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞周期的比较 通过流式细胞实验分析各组细胞周期的变化，与对照组相比，抑制剂组细胞周期G0/G1期显著增加，S期和G2/M期显著降低，差异有显著的统计学意义（P＜0.05）。见表4。
表4 各组子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞细胞周期的比较（%，）
表4 各组子宫内膜癌细胞HEC1B和Hela细胞细胞周期的比较（%，）
注：与对照组相比，aP＜0.05。
PCOS在临床上较为常见，是一种复杂的多基因功能障碍，遗传因素及环境因素是疾病发生的危险因素，慢性无排卵（即机体排卵功能异常或者丧失排卵功能）、高雄激素血症（即机体产生过量的雄性激素）是其主要特征。PCOS多见于育龄期女性，发病后可出现月经失调、多毛、不孕、痤疮等症状。PCOS患者患子宫内膜癌的概率风险较高，其机制可能与长期慢性炎症、无排卵或黄体功能不良有关。女性长时间月经失调后，体内的雌激素会长期刺激子宫内膜，当机体内缺乏孕酮或孕酮数量不足时会影响子宫内膜的周期性改变，从而使得子宫内膜长时间处于增生状态，而长期的炎症状态也增加了癌症进展的风险及肿瘤细胞增殖、转移的风险。c-Fos/MAPK信号通路分子在正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤组织和卵巢恶性肿瘤组织中均有不同水平的表达，一项针对PCOS的转录组学和表观遗传学综合研究表明，MAP3K1和MAP1LC3A启动子甲基化可以通过影响自噬影响PCOS患者发生卵巢癌的风险。
c-Fos/MAPK是宫颈癌等多种女性肿瘤发生、发展及转移的重要调控信号通路，研究表明P38 MAPK/c-Fos信号通路可通过增强子RNA SLIT2的调节抑制乳腺癌骨转移Fos受体FosL2可以受到EphA2超级增强子的招募激活靶基因EphA2来促进肿瘤进展，同时研究表明c-Fos也参与了细胞周期的调控，在子宫癌细胞系中的研究表明通过对AKT和MAPK通路表达的调控可以抑制癌细胞增殖和促进凋亡，药物非西汀治疗还通过调节MAPK信号通路影响JAK-STAT/NF-kB途径改善氧化应激并减轻炎症；
也有研究表明MAPK信号通路可以直接调控细胞周期，其可以受到MAGT1调控，影响细胞的增殖与细胞周期调控，敲除MAGT1使细胞增殖受到S期阻滞和凋亡的限制，p21、cyclin-A1和cyclin-B1的表达增加，以及MYC、cyclin-D1、cyclin-E1和CDK2的表达降低，以上研究均提示c-Fos/MAPK信号通路对肿瘤细胞的增殖、凋亡细胞周期调控发挥重要作用，并且对细胞周期蛋白Cyclin D1具有调控作用。本研究通过两种子宫内膜癌细胞系证实阻断c-Fos/MAPK信号通路，对于细胞增殖具有抑制作用，可有效减少活性细胞的比例，而早期凋亡和晚期凋亡比例增加，提示c-Fos/MAPK信号通路的阻断可以抑制细胞的增殖，促进细胞凋亡；
同时流式细胞分析证实细胞周期G0/G1期显著增加，而S期和G2/M期显著降低，提示对此过程伴随着细胞周期的阻断作用；
通过mRNA和Western blot实验，本研究进一步证实了这种细胞周期阻断作用是通过调控细胞周期蛋白CyclinD1和CDK1实现的。
综上所述，本研究证实了c-Fos及MAPK分子在PCOS并发子宫内膜癌患者中呈高表达，其机制可能与MAPK调控的细胞周期蛋白CyclinD1通路的调控有关，本研究可以进一步扩大临床样本量，通过主成分分析和ROC曲线等分析探究c-Fos及MAPK是否可以准确诊断PCOS合并子宫内膜癌的分子标志物，为临床诊断和治疗提供新思路。
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