秦家轩 林达伟 邢金春
四个半LIM结构域基因1(four and a half LIM domains 1, FHL1)蛋白含有四个半LIM结构域,LIM结构域通过调节蛋白相互作用来参与肌动蛋白细胞骨架重构和转录等过程[1]。在多种肿瘤细胞中,FHL1表达水平降低并参与肿瘤的发生、发展[1-2]。目前尚无针对FHL1与泌尿系肿瘤关系的报道,本文系统检索并详细回顾了FHL1与泌尿系肿瘤的相关研究并进行综述。
FHL蛋白家族是含有四个半LIM结构域的蛋白家族,归属于LIM蛋白的单纯LIM蛋白亚类。人FHL蛋白家族由FHL1、FHL2、FHL3和FHL5四个成员构成。FHL1基因位于X染色体q26.3处。LIM结构域拥有一个高度保守的、功能性的双锌指域,其通过调节蛋白相互作用来参与肌动蛋白细胞骨架重构和转录等过程[1]。在FHL1(也称FHL1A)的两个剪接变异体FHL1B和FHL1C中,既含有LIM结构域又含有非LIM结构域。目前FHL1的相关研究主要围绕FHL1与肌肉疾病[1]、心血管疾病[3]和肿瘤的关系展开。在肺癌、乳腺癌、肝癌等多种肿瘤中,FHL1的表达水平降低[2]。
1.FHL1与肾细胞癌:Shen等[4]与Li等[5]采用免疫组化法检测了9例人肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)组织(病理类型不详)及其配对癌旁正常肾组织中FHL1表达情况,结果显示,9例癌旁正常肾组织中FHL1蛋白均有表达,9例RCC组织中FHL1蛋白均无表达;与癌旁正常肾组织比较,RCC组织中FHL1蛋白染色强度明显降低(P≤0.001)。另外,他们采用免疫组化法检测了无配对正常肾组织的50例RCC组织(病理类型不详)中FHL1的表达情况,其中只有4例FHL1蛋白有表达。吕尧[6]通过对TCGA数据库中早期癌症特异表达基因筛选研究发现,在16例stageⅠ期肾乳头状细胞癌(papillary renal cell carcinoma, pRCC)患者(病理亚型不详)样本中,有54%患者的pRCC组织FHL1表达水平高于癌旁正常组织,平均表达差异倍数为14.6。
Yang等[7]采用Microarray法检测了34例人pRCC组织的基因表达谱,来探索pRCC的分子亚型分类。该研究基于组织学特征和Fuhrman核分级系统,将34例pRCC分为四个形态学亚型:1型14例,表现为低Fuhrman分级(≤2级)的小肿瘤细胞;2A型4例,表现为低Fuhrman分级(≤2级)的嗜酸性大肿瘤细胞;1型-2A型混合型5例;2B型11例,表现为高Fuhrman分级(≥3级)的嗜酸性大肿瘤细胞。该研究进一步将四个pRCC形态学亚型归为两类pRCC分子亚型:第1类pRCC包括1型、2A型和1型-2A型混合型,第2类pRCC包括2B型。与第2类pRCC比较,第1类pRCC中FHL1的表达水平明显升高;在第1类pRCC排名前10的高表达转录本中,FHL1的转录本有4个;可以只用7个转录本组合以97%的准确率从分子水平有效区分第1类和第2类pRCC,7个转录本中有3个是FHL1的转录本。Notch信号转导通路对近端肾单位的形成至关重要[8],FHL1的剪接变体FHL1B(也称KyoT3)和FLH1C(也称KyoT2)是Notch信号转导通路的有效抑制剂[9-10],Surendran等[11]通过基因敲除小鼠研究了Notch信号转导通路在肾脏发育和肾脏肿瘤发生中的作用,结果显示,抑制Notch信号会影响小鼠肾脏近端小管形成,导致小鼠肾脏近端小管中出现肾囊肿和肾乳头状微腺瘤;在上述研究中形成的囊肿囊壁上皮细胞中p21wAF1/Cip1(p21)表达缺失,在非囊性近端小管上皮细胞中p21表达,提示p21表达缺失继发于囊肿形成,而不是Notch信号缺失的直接后果;在Notch信号缺失小鼠的肾囊肿中,p21表达缺失可以促进囊壁上皮细胞的增生。肾乳头状腺瘤被认为是人pRCC的前体[12],Surendran等[11]进一步分析了Yang等[7]的微阵列基因芯片(Microarray)数据,发现在人第1类pRCC中,FHL1表达升高和Hey1表达降低之间存在显著相关性,而Hey1是Notch信号转导通路的靶点,FHL1的剪接变体FHL1B和FLH1C是Notch信号转导通路的有效抑制剂;同时,他们采用免疫组化法检测了FHL1B在6例人pRCC组织中的表达情况,发现FHL1B在4例第1类pRCC的细胞核中明显表达,在2例第2类pRCC和正常肾组织中表达缺失。他们的研究结果提示,Notch信号通路的抑制与人第1类pRCC的产生有关,这与Notch信号缺失小鼠肾脏近端小管中肾乳头状微腺瘤的形成类似;FHL1及其剪接变体可能通过抑制Notch信号通路参与人第1类pRCC的产生。
Bratslavsky等[13-14]采用Microarray法检测了美国国家癌症研究所的11例希佩尔-林道(von Hippel-Lindau, VHL)综合征患者的22个配对肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)病灶标本,来比较同一个体的同一肾脏中长径大于3 cm(大病灶)和长径小于2 cm(小病灶)的ccRCC病灶间的基因表达差异。上述11例VHL综合征患者分别在同一次手术中切除了同侧肾脏的2个或2个以上的ccRCC病灶,每例患者至少有一个大病灶和一个小病灶以备选为配对ccRCC病灶标本,同一患者入选配对的大、小病灶标本的Fuhrman核分级相同,以求排除个体差异、病理差异对研究结果的影响。研究结果显示,在VHL综合征患者中,与长径小于2 cm的相同核分级的ccRCC病灶比较,长径大于3 cm的ccRCC病灶有65个差异表达基因,其中37个基因表达差异≥1.5倍(5个表达升高,32个表达降低);FHL1在长径大于3 cm的ccRCC病灶和长径小于2 cm的ccRCC病灶中表达水平差异明显。
2.FHL1与前列腺癌(prostate cancer, PCa):Shen等[4]与Li等[5]采用免疫组化法检测了9例人PCa组织及其配对癌旁正常前列腺组织中FHL1表达情况,结果显示,2例PCa组织和6例癌旁正常前列腺组织中FHL1蛋白有表达;9例PCa组织中FHL1蛋白染色强度明显低于配对癌旁正常前列腺组织(P≤0.01)。另外,他们采用免疫组化法检测了40例PCa组织中FHL1的表达情况,其中只有4例评分被判定为FHL1蛋白有表达;与Gleason评分≤7分的17例PCa组织比较,Gleason评分≥8分的23例PCa组织中FHL1蛋白的表达例数(0.05 前列腺由胚胎泌尿生殖窦发育而来,泌尿生殖窦间充质内有一个明确的区域参与启动和调节前列腺器官的发生,该区域被称为腹侧间充质板(ventral mesenchymal pad, VMP)[15]。间充质细胞可以参与器官形成和肿瘤发生。Vanpoucke等[16]采用基因表达序列分析技术(serial analysis of gene expression, SAGE)构建了一个包含大鼠VMP细胞的SAGE文库(VMP文库)和一个包含大鼠所有前列腺前体细胞(VMP细胞、平滑肌细胞、尿道上皮细胞)的SAGE文库(VSU文库),对比发现VMP文库中FHL1基因表达水平明显高于VSU文库。基质微环境在前列腺器官发生和肿瘤发生中起着关键作用,癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)可以通过多种机制促进肿瘤发生[17]。Orr等[18]采用高通量测序技术(next-gen sequencing, NGS)对PCa患者的 CAFs、配对正常前列腺成纤维细胞(normal human prostate fibroblasts, NPFs)和意外终止妊娠后获得的人胚胎前列腺组织细胞(embryonic prostate, EMB)进行测序分析,结果显示,3组细胞中FHL1基因表达水平为CAFs Zhang等[19]采用iTRAQ蛋白质组学技术分析了人PCa高转移性PC-3M-1E8细胞株和低转移性PC-3M-2B4细胞株之间的蛋白表达差异发现,与低转移性PC-3M-2B4细胞株相比,高转移性PC-3M-1E8细胞株有28个蛋白表达水平明显升高、30个蛋白表达水平明显降低,其中FHL1蛋白表达水平降低最为明显;生物信息学分析提示,上述差异蛋白主要参与肌动蛋白细胞骨架调节、谷胱甘肽代谢、病毒致癌、造血等细胞通路,在蛋白相互作用分析中主要富集于基因表达、线粒体组构、细胞骨架组构、细胞迁移、上皮细胞间叶转化、细胞周期和凋亡等过程;FHL1的mRNA水平和蛋白水平分别通过Western blotting法和实时定量PCR法在两株细胞中进行进一步验证,验证结果与iTRAQ蛋白质组学结果一致,PC-3M-1E8细胞株FHL1蛋白和mRNA水平均明显低于PC-3M-2B4细胞株。研究结果提示FHL1与PCa转移潜能相关。 Verma等[20-21]将人PCa细胞系LNCaP和C4-2B暴露于20 μmol药物浓度的恩杂鲁胺(enzalutamide)6个月以上,获得两个恩杂鲁胺耐药细胞系(LNCaP ENZU和C4-2B ENZU),随后采用高通量测序技术检测LNCaP ENZU和C4-2B ENZU细胞系与各自亲本细胞系(LNCaP和C4-2B)之间的基因表达差异并进行生物信息学分析,发现差异表达基因主要参与代谢重编程;与恩杂鲁胺敏感的亲本细胞系LNCaP相比,恩杂鲁胺耐药细胞系LNCaP ENZU中FHL1的mRNA水平升高10倍以上。研究结果提示FHL1与PCa耐药相关。 3.FHL1与膀胱癌(bladder cancer, BCa):Matsumoto等[22]通过对比分析BCa组织和正常膀胱组织的基因表达差异、去甲基化试剂(5-aza-dC)处理前后BCa细胞的基因表达差异发现,FHL1可能是BCa中的抑癌基因。他们进一步通过实时定量PCR法和实时定量甲基化特异性PCR法(qMSP)检测了70例人BCa组织和10例人正常膀胱组织中FHL1 mRNA的表达水平和甲基化程度,发现人BCa组织FHL1 mRNA的表达水平明显低于正常膀胱组织,人BCa组织中FHL1的甲基化指数明显高于正常膀胱组织;通过划痕实验、侵袭实验、二甲氧唑黄增殖实验发现,在BCa细胞株中过表达FHL1基因后,BCa细胞的迁移和侵袭能力明显受到抑制,增殖能力无明显影响。 Arum等[23]将同基因大鼠BCa细胞系(AY-27)接种于雌性Fischer大鼠膀胱内,建立原位大鼠BCa模型,用Microarray法检测上述大鼠BCa组织和大鼠正常膀胱组织间的差异表达基因;同时分析了前人发表的3份人膀胱癌Microarray数据,包含:①53例人BCa组织和5例人正常膀胱组织;②46例人BCa组织和9例人正常膀胱组织;③21例人BCa组织和4例人正常膀胱组织。他们的研究发现,与各自的正常膀胱组织比较,人和大鼠的BCa组织中FHL1表达水平均明显降低。 Zaravinos等[24]采用全基因组Microarray法分析了10例人BCa组织和5例人正常膀胱组织的基因表达谱,发现BCa组织中最活跃的染色体是9号染色体和X号染色体,X号染色体在正常膀胱组织中也具有高活跃度;BCa组织中,4、8、13、21、22和X号染色体的一些差异表达基因之间呈显著线性相关(P<0.05),X号染色体上显著线性相关的10个基因中包含FHL1;不同BCa组织样本同一染色体的某些差异表达基因之间存在线性相关性,提示这些基因可能参与肿瘤进展。 目前FHL1在泌尿系肿瘤中的相关研究主要集中在RCC、PCa和BCa的部分病理类型中。FHL1在大多数PCa和BCa组织中低表达,与PCa的发生、转移和耐药相关,与BCa的迁移和侵袭相关,参与肿瘤进展,目前缺乏FHL1在PCa和BCa不同病理类型中的相关研究。不同病理类型的RCC组织中FHL1表达水平不同,不同pRCC亚型的FHL1表达水平不同,VHL综合征患者不同长径的ccRCC病灶中的FHL1表达水平不同,提示FHL1和RCC的关系复杂,有必要进行更多的亚组分析。ccRCC和其他病理类型RCC的组织病理学表现和临床预后不同。FHL1在不考虑病理类型的RCC样本中低表达,而在Fuhrman分级≤2级的pRCC样本中高表达,FHL1及其剪接变体可能通过抑制Notch信号通路参与低Fuhrman分级(≤2级)pRCC的产生。pRCC的预后和对现有酪氨酸激酶抑制剂类靶向药物的反应不同于ccRCC,pRCC组织中囊变、坏死、出血等较为常见,本综述相关内容为pRCC后续研究提供了有价值的指引和参考。 病理类型、病理形态学分级、临床分期、病灶尺寸、FHL1及其剪接变体FHL1B和FLH1C的分别检测等,是现有研究结果可靠性的潜在影响因素,也是未来研究方案设计中的考虑因素。