陈祖椿，张建桦，陈月碧，张 宁，郭昱嵩，王中铎，董忠典,2
（1.广东海洋大学水产学院/南海水产经济动物增养殖重点实验室，广东 湛江 524088；
2.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东 湛江 524088）
盐度是水生生物生存的重要影响因素，水体盐度可能会影响污染物的理化性质或生物富集污染物的能力[10]，因而环境污染物在不同盐度水体中对生物的毒性效应可能不同。目前，双酚类物质的水生生态风险研究主要集中在BPA 对斑马鱼等淡水物种的毒性方面[11-12]，缺乏关于BPA 类似物BPF 等对广盐性鱼类的毒性研究。海洋青鳉（Oryzias melastigma）是一种盐度适应性强的新兴海洋生态毒理学模式生物[13]，本研究在盐度15（模拟半咸水环境）和30（模拟海水环境）条件下，将海洋青鳉胚胎暴露于不同浓度BPF，分析BPF对胚胎的毒性效应，为科学评估BPF对海洋环境的生态风险提供依据。
1.1 实验生物
海洋青鳉亲本由广东海洋大学南海水产经济动物增养殖重点实验室饲养培育，培养的光暗周期为14 h/10 h，水温（26±1）℃。实验用胚胎均产自同一批性成熟、健康无病的海洋青鳉亲本。每日10:00用捞网捞起抱卵雌鱼，用手指轻推，剥离并收集受精卵，操作过程中避免雌鱼损伤。
1.2 双酚F胚胎暴露实验
挑选卵径基本一致、形态正常的胚胎进行暴露实验。暴露盐度设为15和30，每个盐度下BPF质量浓度分别为0、1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L、1 mg/L、10 mg/L。BPF 助溶剂为二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO），所有组DMSO 体积分数为0.01%[14]。每个处理设置4 个平行，每个平行中放置10 枚受精4 h左右的胚胎。当日产胚胎于体式显微镜下人工剔除未受精胚胎和死亡胚胎，随机置于12孔板的孔洞中，10枚/孔，将不同浓度暴露液转移至相应孔洞中。孔板置于（28±1）℃恒温、光照培养箱内培养15 d，每24 h 更换1 次暴露液，照度1 745 lx，光暗周期为14 h/10 h。
每日在显微镜下观察并记录胚胎孵化和死亡情况，统计畸形数量和畸形类型，及时清除死亡胚胎[15]。在胚胎发育过程中陆续有仔鱼孵化出膜，每日更换暴露液时将各组孵化仔鱼收集到新24 孔板中，用与该处理组相同的暴露液处理仔鱼，暴露液每24 h更换1次。实验过程中及时发现和清除死亡仔鱼，计算仔鱼出膜后7 d内的存活率。
1.3 胚胎心跳速率检测
在实验6 d（受精后144 h）和9 d（受精后216 h）时统计胚胎心跳速率（下称“心率”）。将装有胚胎的孔板置于体式显微镜下观察胚胎心脏跳动，用显微镜配套观察软件录制成时长1 min 的AⅤI 视频文件，观察视频中的心跳，用计数器计数。每个平行选取5 枚心脏跳动明显的胚胎进行计数，计算各浓度处理组胚胎心率。
1.4 双酚F暴露下仔鱼行为分析
在胚胎孵化出仔鱼后，在出膜后48 h 用小型鱼类行为学分析系统（ⅤiewPoint，法国）分析其行为。将待测仔鱼放入新的24 孔板中，每个孔洞仅1 尾仔鱼。先依次在软件上对每个孔根据其处理组进行命名，再设定分析程序，分析时长为15 min，记录其游动总距离，软件每3 min 输出1 次数据，其中前3 min 为仔鱼适应阶段，不计入结果。在测定过程中保持光照稳定，避免噪音等其他外界环境因素干扰。每个处理组测定20尾仔鱼的行为数据。
1.5 数据处理
使用Excel 2018统计数据，数据以平均值±标准差表示，使用SPSS Statistics 26、GraphPad Prism9 软件进行分析和绘图。用双因素方差分析（Two-way ANOⅤA）检验盐度和BPF对海洋青鳉胚胎的影响。
2.1 不同盐度下双酚F 对海洋青鳉胚胎畸形率、孵化率和死亡率的影响
本研究中产生部分畸形胚胎，但数量较少。15盐度下1 μg/L 处理组畸形率为13.3% ± 4.5%，包括4 个卵黄囊水肿和1 个卵膜破裂的胚胎；
100 μg/L 处理组畸形率为5.0%±5.8%，包括2 个卵黄囊水肿的胚胎。在30 盐度下10 μg/L 处理组的畸形率为2.8% ± 5.6%；
10 mg/L 处理组的畸形率为3.6% ±7.2%。两个处理组均发现1 个卵黄囊水肿的胚胎。其余处理组均未发现畸形胚胎。
曾经有人指出，课堂教学是一个向着未知方向不断深入的探索历程，意外而美丽的风景随时都可能出现在路边，因此我们的教学不能循着固定的路径来进行，否则课堂将缺乏意外的生成，也就无法激起学生创造的热情.所以，教师应该意识到高中化学的教学不应该是一个预约的过程，而应该是一个学生与教师、学生与教材碰撞和沟通的过程，只有将这一思想贯彻在化学教学中，学生才能看到那些意外而美丽的风景.
表1可见，在15盐度下，随着BPF暴露浓度的增加，海洋青鳉胚胎的孵化率虽与对照组无显著差异，但有下降趋势。在30盐度下，随着BPF暴露浓度的增加，胚胎孵化率呈降低趋势，100 μg/L、1 mg/L、10 mg/L 处理组显著低于对照组（P＜0.05），其中10 mg/L处理组显著低于10 μg/L处理组（P＜0.05）。对比相同BPF 浓度下不同盐度的处理组，当BPF 在100 μg/L 和10 mg/L 时，30 盐度下的孵化率显著低于15盐度，其余BPF处理浓度下虽无显著差异，但也表现出30盐度下孵化率低于15盐度的趋势。15盐度下10 μg/L处理组较1 μg/L处理组出现了一定的孵化率回升趋势。在30 盐度下，10 μg/L 处理组较1 μg/L处理组也显示出孵化率回升趋势，10 μg/L BPF处理组的孵化率平均值均高于其他BPF处理组。
表1 各处理组海洋青鳉胚胎孵化率和死亡率Table 1 Hatching rate and mortality rate of marine medaka in each treatment group
15 盐度下，BPF 各浓度的胚胎死亡率与对照组均无显著性差异。30 盐度下，10 mg/L 处理组的死亡率平均值与对照组差异相对较大，在30盐度下高浓度的BPF 具有明显的胚胎致死效应。在相同的BPF 处理浓度下，30 盐度组的死亡率平均值均高于15盐度组，在BPF浓度为10 mg/L时，30盐度组的死亡率显著高于15盐度组（P＜0.05）。
2.2 不同盐度下双酚F对海洋青鳉胚胎心率的影响
在BPF 处理6 d 时，15 盐度下的1 mg/L 处理组心率最高，显著高于对照组（DMSO 处理组）和其他浓度处理组（P＜0.05）；
30 盐度下随着BPF 浓度的升高，海洋青鳉心率有降低趋势，10 mg/L 处理组心率最低，显著低于对照组和其他浓度处理组，1 μg/L处理组心率平均值最高，1 mg/L 处理组心率显著低于对照组和1 μg/L 处理组，10 μg/L 处理组心率也显著低于1 μg/L 处理组（P＜0.05）。当BPF 处理浓度在1 μg/L 时，30 盐度组的心率显著高于15 盐度组（P＜0.001）。而当BPF 处理浓度在1 mg/L 及以上时，30 盐度组的心率显著低于15 盐度组（P＜0.001），且BPF处理浓度越高，心率就越低（表2）。
表2 6 d和9 d时各处理组海洋青鳉胚胎心率Table 2 Heart rate of marine medaka embryos in each treatment group on day 6 and 9 次/min
在BPF处理9 d时，15盐度下10 mg/L处理组心率最低，显著低于对照组和其他浓度处理组，1 mg/L处理组心率显著低于对照组（P＜0.05）。当BPF 处理浓度在1 μg/L、10 μg/L、100 μg/L 和1 mg/L 时，30盐度组的心率显著低于15 盐度组（P＜0.001）。在对照组，30 盐度时的心率同样显著低于15 盐度时（P＜0.000 1）。而当BPF处理浓度在1 mg/L及以上时，无论何种盐度，心率均较低（表2）。
2.3 不同盐度下双酚F 对海洋青鳉仔鱼出膜后7 d内存活率的影响
仔鱼出膜7 d 内死亡数量较少，各浓度下基本无死亡。15 盐度下，100 μg/L 处理组死亡1 尾，死亡率为2.5%±5.0%，10 mg/L 处理组死亡2 尾，死亡率达到8.6%±10.2%。30盐度下，DMSO和10 μg/L处理组均有1 尾死亡，死亡率分别为2.5% ± 5.0%、3.1% ± 6.3%。1 μg/L 和1 mg/L 处理组均有2 尾死亡，死亡率为7.7%±9.0%。
2.4 不同盐度下双酚F对海洋青鳉仔鱼行为的影响
各处理组海洋青鳉仔鱼运动平均总距离呈现一定波动，但在统计学上无显著差异（P＞0.05）（图1）。在DMSO、1 μg/L、10 μg/L 处理组中，随BPF 浓度上升，出膜48 h 的仔鱼在12 min 内运动总距离（由于10 mg/L 处理组出膜数量较少，故不参与行为学分析）有增加趋势。在相同浓度下，盐度30 的仔鱼运动总距离平均值均高于盐度15。
图1 各处理组海洋青鳉仔鱼运动总距离Fig.1 Total distance of movement of fries in each treatment group
3.1 不同盐度下双酚F 对海洋青鳉胚胎畸形率、孵化率和死亡率的影响
畸形率、孵化率和死亡率是评价化学物质对鱼类发育毒性和安全性的重要指标。有研究指出，BPA 对斑马鱼胚胎的畸形率随BPA 浓度的升高而增大[16]；
BPF 会对斑马鱼早期生命阶段的内分泌产生干扰，BPF 暴露下产生的畸形率会随BPF 浓度的升高而增大[17]；
在对日本青鳉（Oryzias latipes）的研究中也发现，BPA 在环境相关浓度下会引起青鳉的短暂性胚胎畸形[18]。本实验中产生的畸形胚胎数量较少，在15 盐度下畸形总数和畸形率略多于30 盐度，畸形类型普遍为卵黄囊水肿，但未得出BPF 浓度和盐度对海洋青鳉胚胎的畸形效应。
在孵化率方面，任文娟等[19]研究显示，斑马鱼孵化率随着BPF 暴露浓度的升高而呈现阶梯式下降。黄乾生等[20]在探究盐度影响PFOS 对海洋青鳉的毒性时发现，在30 盐度下，对照组、1 mg/L、4 mg/L 和16 mg/L PFOS暴露组的孵化率均低于5盐度条件下的同浓度组孵化率，本研究有类似结果，较高的BPF暴露浓度对海洋青鳉胚胎孵化率也产生一定影响；
盐度对孵化率也存在影响，各处理组30盐度下孵化率均有低于15 盐度的趋势，说明在较高盐度环境下，污染物对海洋青鳉胚胎的孵化有更强的抑制作用。胚胎的成功孵化依赖于孵化酶的正常表达。高卵壳裂解酶(High choriolytic enzyme，HCE)和低卵壳裂解酶(Low choriolytic enzyme，LCE) 等两种重要孵化酶的协同作用可催化绒毛膜的降解，促进胚胎孵化[21]。有机污染物PFOS会造成HCE 和LCE的mRNA 表达异常，影响其活性[22]。海洋青鳉暴露于0.2和0.8 mg/L的四氯双酚A（TCBPA）后，孵化酶HCE 和LCE 的表达水平均受显著抑制[23]。本研究的高盐度对海洋青鳉胚胎孵化率的影响可能是高盐度导致HCE和LCE表达水平受抑制所致。
在非适宜盐度环境下，污染物对生物的毒性往往增强。陆彬[24]在研究盐度及两种手性拟除虫菊酯对斑马鱼胚胎毒性的影响时发现，顺式联苯菊酯外消旋体（cis-BF）对斑马鱼胚胎的急性毒性随水体盐度的升高而增强，高盐度增强了cis-BF 的毒性和斑马鱼胚胎对cis-BF的富集作用。本研究亦有类似结果，在盐度15 条件下，BPF 暴露浓度的上升并未显著提升海洋青鳉的死亡率，但在30 盐度条件下，10 mg/L BPF浓度暴露下的存活率比对照组出现较大程度下降，且显著低于15盐度下同BPF浓度暴露组，这表明高盐度使BPF对海洋青鳉胚胎的毒性增强。
3.2 不同盐度下双酚F对海洋青鳉胚胎心跳速率的影响
胚胎心率可判断鱼卵胚胎在毒性环境下的毒性效应，也是评价和分析毒性物质的重要指标之一[25]。Moreman[26]在研究双酚类化学品对斑马鱼的分子机制和健康影响时发现，BPA、BPF、双酚S和双酚AF 均优先靶向作用于斑马鱼的心脏，较高浓度BPA（2 500 μg/ L）暴露会诱导心房、心室不稳定的搏动配给，使心率降低；
BPA 在暴露浓度为150 μg/L时，会导致与离子转运和细胞间通讯相关的许多基因下调，这些功能对于维持规律的心率至关重要。Mu 等[27]研究发现，斑马鱼胚胎暴露于0.000 5、0.5、5.0 mg/L的BPF时，会导致心率下降；
通过转录组学分析，心脏发育相关基因（klf2a）在暴露于0.000 5或0.5 mg/L BPF 后下调。本研究中，BPF 对海洋青鳉胚胎心率也有类似影响，处理6 d 时的30 盐度组和处理9 d 时的15 盐度组，高浓度BPF（≥1 mg/L）也会导致心率下降，表明一定浓度的BPF 暴露对海洋青鳉胚胎心脏发育具有毒性效应，影响其心率。
盐度对硬骨鱼的心脏存在一定影响。海洋青鳉胚胎出膜前后（孵化后8、11 d）的平均心率随着盐度的增加而显著增加[28]，而在盐度30、15、5 条件下，随着盐度的降低，全氟辛烷磺酸（PFOS）显著上调了海洋青鳉胚胎中PPARα、PPARβ、COX-2和SMYD1等心脏发育相关基因的表达[20]。但本研究中，相对于盐度15，盐度30 条件下海洋青鳉心率往往较低。这可能是由不同盐度下BPF 对心脏发育相关基因表达的影响不同所致[29-30]。此外，在部分低BPF 浓度（1 μg/L）处理6 d 时，盐度30 心率比15 有升高趋势，这是由于在6 d 及以前，是机体器官的形成时期[31]，较高的心率有利于心脏泵血，维持渗透压平衡、为器官形成提供保障[32]。
3.3 不同盐度下双酚F 对海洋青鳉仔鱼出膜后7 d内存活率和仔鱼行为的影响
鱼类仔鱼出膜后7 d 内存活率是评估污染物对其幼体毒性的重要参数。任文娟等[33]研究发现，BPF 对斑马鱼成鱼和胚胎有高度相近的致死率，成鱼死亡率随浓度升高而升高。本实验中仔鱼死亡数和死亡率较小，未发现浓度和盐度对仔鱼死亡率的显著影响，可能与海洋青鳉是广盐性鱼类，出膜后各种调节机制日趋完善，对外界环境适应性相对较强有关[34]。
污染物对仔鱼行为往往有一定影响，Mu等[35]研究表明，斑马鱼胚胎暴露于一定浓度的BPF中，会抑制自发运动。顾杰等[36]在探索BPF对斑马鱼的早期神经毒性时发现，BPF暴露会显著抑制斑马鱼仔鱼的运动距离和平均速度，对斑马鱼仔鱼的运动行为能力产生影响。陈将飞[37]在研究TBBPA对斑马鱼的毒性效应时发现，低剂量TBBPA暴露可引起受精后5 d仔鱼运动速度显著上调。本研究中并未发现仔鱼总运动距离与BPF浓度的明显线性关系，且在各浓度BPF处理组中仔鱼平均总运动距离多高于对照组，表明双酚类物质对不同鱼类的行为影响存在差异。
3.4 盐度和BPF对海洋青鳉的复合效应
不同盐度下生物体对化学物质蓄积能力不同，盐度的增加导致部分污染物的生物蓄积量变化。海洋青鳉卵内PFOS 浓度均随盐度升高呈上升趋势[20]，而日本青鳉体内五氯苯酚累积量随着盐度的增加而减少[38]。Borrirukwisitsak 等[39]在探究盐度等对BPA辛醇-水分配系数（Kow）的影响时发现，随着盐度的增加，25 ℃时BPA 的Kow 对数从3.44 增加到3.55，他们由此认为海洋环境中的BPA 可能有更强的生物蓄积性。Onaizi[40]在探究酚类废水处理时发现，盐的存在严重降低了BPA 的降解率和去除率。因此，盐度和BPF 对生物的毒性存在复合作用。总之，盐度对污染物生物累积的影响因物种和污染物而异，结合本研究结果，推测盐度的增加会导致BPF在海洋青鳉胚胎内蓄积量增加。
盐度在鱼类胚胎发育过程中起重要作用，盐度过高或过低均造成受精卵卵膜渗透压改变[41-42]。钠钾泵Na+/K+-ATPase（NKP）调节是维持细胞渗透压稳态的重要机制，有假说认为，对于非洄游广盐性硬骨鱼，NKP 活性在其最适宜的盐度环境中表达量最低[43]。万磊[10]在探究海洋青鳉鱼最适的盐度环境时发现，海洋青鳉NKP基因转录水平在15盐度条件下低于30盐度，即相对于30的盐度而言，盐度15可能是海洋青鳉更适宜的盐度环境。高盐度需要利用ATP调节渗透压，进而减少用于解毒或消除异生物质的能源[44]。结合本研究结果，虽然海洋青鳉是广盐性鱼类，在高盐度下需要消耗部分能量维持细胞渗透压稳态，导致海洋青鳉胚胎用于消除BPF影响的能源减少，从而增强了BPF对海洋青鳉胚胎的毒性效应。
BPF对海洋青鳉胚胎有一定的毒性效应，对其孵化率、死亡率、心率均有显著影响。盐度对BPF的毒性有复合效应，不同盐度（30和15）下，BPF对海洋青鳉胚胎心率、孵化率和死亡率的影响存在显著差异，高浓度BPF在盐度30条件下对胚胎有明显的致死效应，说明盐度影响了海洋青鳉胚胎对BPF的敏感性。
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