代丽凤，蒋洁琳，官兴丽*，邹小林，杨 智，符宗林，罗 赛
（1. 云南省普洱茶发酵工程研究中心，云南 昆明 650217；
2. 云南大益微生物技术有限公司，云南 昆明 650217；
3. 勐海茶业有限责任公司，云南 勐海 666200）
【研究意义】普洱熟茶是以云南大叶种晒青茶（Camellia sinensisvar.assamica）为原料，通过渥堆发酵而成，含有丰富的茶褐素和没食子酸[1]，具有降血脂[2]、降血糖[3]、抗肥胖[4]、调节肠道菌群[5-7]、抗炎[8,9]、抗氧化[10]、抗癌[11]等生物活性。玫瑰（Rosa rugosaThunb.）为蔷薇科蔷薇属植物，富含多酚、多糖及花青素类物质[12]，具有抗氧化、抑菌、抗癌和免疫调节等生理活性[13-16]。墨红玫瑰具有香味浓郁、花期长、产量高等特点，其中作为食用玫瑰的主要品种在云南广泛种植[17]。葡萄籽是葡萄科葡萄属葡萄（Vitis viniferaL.）的种子，富含原花青素、白藜芦醇、葡萄籽油等营养物质[18]，具有防止氧化损伤、抗糖尿病、抗肿瘤、抗辐射、抗肥胖、保护心血管等诸多功效[19-22]，因而常被用于保健食品的制作，功能声称多为抗氧化、祛黄褐斑和增强免疫力等。【前人研究进展】自GB/T 22111—2008《地理标志产品 普洱茶》实施以来，速溶茶粉、液态饮料等普洱茶深加工产品日益增多[23]，但多以口味和便携性为卖点，较少体现茶饮的功能属性。与中国红一号、滇红、大马士革相比，墨红玫瑰多酚含量最高，为 198.07±5.78 mg·g-1，是大马士革的1.92倍，且清除DPPH（1,1-二苯基-2-苦基肼）自由基的能力最强，具有良好的抗氧化活性[24]。云南食用玫瑰花目前仍以鲜花、干花等初加工产品形式为主，深加工产品较少[25]，未充分发挥玫瑰的营养与药用价值。含葡萄籽的普通食品主要包括油、粉、固体饮料、果汁饮品、压片糖果等产品。全国葡萄籽可利用产量约5 000～6 000 t，但在葡萄酒酿制过程中，葡萄籽常作为废渣被丢弃[26]，造成资源浪费。【本研究切入点】普洱茶作为云南省地理标志产品，目前仍以传统原叶茶为主要形式在市场流通，深加工产品较为缺乏，且未见普洱茶与葡萄籽共同搭配研制的食饮品。【拟解决的关键问题】以普洱熟茶、云南墨红玫瑰、葡萄籽为主要原料，复配药食同源材料枸杞及山楂，通过单因素和响应面试验对饮料最佳配比工艺进行优化，利用原材料特性开发抗氧化新产品，旨在推动云南高原特色产业普洱茶和玫瑰花的深化发展，同时加强对葡萄籽废物利用，助推绿色低碳经济发展。
1.1 材料与仪器
普洱熟茶（益原素发酵茶），勐海茶业有限责任公司提供；
墨红玫瑰、葡萄籽、山楂、枸杞均为市售。
主要试剂：甲醇（色谱纯，天津市富宇精细化工有限公司）；
DPPH（纯度＞97.0%，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司）；
ABTS（2,2"-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐，纯度≥98%，北京索莱宝科技有限公司）；
过硫酸钾（纯度99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
维生素C（纯度≥99%，上海源叶生物科技有限公司）。
主要仪器：TB-215D型电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；
RY-UHT-20L型超高温杀菌机（上海锐元机械设备有限公司）；
AMR-100型酶标仪、MB100-2A型微孔板恒温振荡器（杭州奥盛仪器有限公司）；
E2695高效液相色谱仪（配置2998二极管阵列检测器，美国Waters公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 工艺流程
1.2.2 操作要点
浸提液制备：均按料水比1∶10（g∶mL），恒温浸提2次，每次30 min，过滤冷却后离心备用。其中普洱茶与葡萄籽浸提温度为90℃，山楂浸提温度为80℃，枸杞浸提温度为70℃。
玫瑰花冷萃液制备：粉碎，按玫瑰花、冰水混合物比1∶10（g∶g），4℃恒温浸提2次，每次3 h，过滤，离心备用。
离心：4 500 r·min-1，离心 15 min。
灭菌：采用超高温瞬时灭菌（UHT），130℃灭菌15 s。
灌装：无菌瓶灌装饮料。
1.3 单因素试验
以200 mL为基准，各因素水平分别设置为普洱茶浸提液5%、10%、15%、20%、25%；
玫瑰花冷萃液1%、2%、3%、4%、5%；
葡萄籽浸提液3%、4%、5%、6%、7%；
山楂浸提液0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；
枸杞浸提液1%、2%、3%、4%、5%，均为体积分数。加水定容，混匀，感官评分，以确定各因素的最佳添加量。
1.4 响应面试验
以单因素试验为基础，选取普洱茶浸提液、玫瑰花冷萃液、葡萄籽浸提液、山楂浸提液4个因素，利用Design Expert 13软件，设计4因素3水平Box-Behnken中心组合试验，设置复合饮料的感官评分为评价指标，响应面试验因素及水平设计见表1。
表1 Box-Behnken试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels in Box-Benhnken experiment
1.5 感官品质评定
审评人员共10名，男女各5名，均具备一定的审评专业知识与味觉敏感性，并于审评前统一培训，明确评分准则。参考GB/T 21733—2008《茶饮料》，根据饮料的色泽、状态、气味、滋味4个指标对饮料进行感官评定，评分标准如表2所示，总分为100分。
表2 普洱茶玫瑰花葡萄籽复合饮料感官评价标准Table 2 Sensory evaluation of pu-erh tea rose grape seed compound beverage
1.6 质量指标测定
1.6.1 理化指标
参照NY/T 3675—2020《红茶中茶红素和茶褐素含量的测定 分光光度法》测定茶褐素含量；
采用GB/T 21733—2008《茶饮料》规定的方法测定茶多酚含量；
按GB 5009.139—2014《食品安全国家标准 饮料中咖啡因的测定》对咖啡因含量进行测定；
高效液相色谱法测定没食子酸[27]；
苯酚-浓硫酸法测定多糖[28]；
三氯化铝法测定黄酮[29]。
1.6.2 微生物指标
菌落总数、霉菌和酵母、大肠菌群等微生物指标，分别参照GB 4789.2—2022《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》、GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》、GB 4789.3—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》进行测定。
1.7 抗氧化性能测定
1.7.1 DPPH法
主要参照CHENG Z H等[30]的方法。DPPH贮备液需现配现用，精准称取7.2 mg DPPH溶解于25 mL甲醇中，避光保存待用。取1 mL DPPH贮备液加甲醇稀释至5 mL，即为DPPH工作液。将100 μL稀释20倍的样品溶液添加至96孔板中，对照孔中加入100 μL甲醇，然后每组加入100 μL DPPH工作液，盖上盖子，放入恒温振荡器振荡均匀，常温下避光反应20 min。以甲醇为空白对照，20 μg·mL-1维生素C为阳性对照。将96孔板置于酶标仪内，于517 nm波长下检测吸光值（A）。DPPH自由基的清除率按式（1）计算：
1.7.2 ABTS法
主要参照THAIPONG K等[31]的方法。将7.4 mmol·L-1ABTS 溶液和 2.6 mmol·L-1过硫酸钾溶液等体积混合，室温下避光反应12 h，作为ABTS贮备液。350 μL ABTS 贮备液用甲醇稀释至3 mL，使其在734 nm下的吸光值为0.8±0.02，即为工作液。将100 μL稀释20倍的样品溶液添加至96孔板中，对照孔中加入100 μL甲醇，然后每组加入100 μL ABTS工作液，盖上盖子，放入恒温振荡器振荡均匀，常温下避光反应20 min。以甲醇为空白对照，20 μg·mL-1维生素C为阳性对照。将96孔板置于酶标仪内，于734 nm波长下检测其吸光值（A）。ABTS自由基的清除率按式（2）计算：
1.8 数据处理
采用Origin 9.1制图、SPSS 25处理单因素试验数据、Design Expert 13分析响应面试验数据。每个试验重复3次。
2.1 单因素试验
2.1.1 普洱茶浸提液添加量
由图1可知，普洱茶浸提液添加量对复合饮料感官评分有明显影响，在15%的添加量下，复合饮料感官评分最高，且与其他添加量相比具有显著差异（P＜0.05）。此时的饮料茶汤红亮，澄清透明，滋味丰富，具有复合饮料的风味。普洱茶浸提液添加量低于15%，饮料呈棕红色，滋味单薄、稍显寡淡。普洱茶浸提液添加量高于15%，饮料呈暗褐色，花香黯淡，滋味苦涩。综合分析，确定普洱茶浸提液添加量为15%。
图1 普洱茶浸提液添加量对复合饮料感官评价的影响Fig. 1 Effect of Pu-erh tea extract on sensory quality of experimental beverage
2.1.2 玫瑰花冷萃液添加量
玫瑰花冷萃液添加量对复合饮料感官评价的影响由图2可知，随着玫瑰花冷萃液添加量的增加，复合饮料的感官评分呈先增后降趋势。玫瑰花冷萃液添加量为3%，复合饮料的感官评分最高，与2%和4%相比，具有显著差异（P＜0.05），此时饮料玫瑰花香浓郁，澄清透明，滋味爽口。玫瑰花冷萃液添加量少于3%，普洱茶陈香较为突出，玫瑰花香不够显著，玫瑰花冷萃液添加量高于3%，玫瑰花香显著，但滋味苦涩，不够愉悦。综合分析，确定玫瑰花冷萃液添加量为3%。
图2 玫瑰花冷萃液添加量对复合饮料感官评价的影响Fig. 2 Effect of rose cold extract on sensory quality of experimental beverage
2.1.3 葡萄籽浸提液添加量
葡萄籽浸提液添加量对复合饮料感官评价的影响由图3可知，在5%的添加量下，其感官评分最高，与4%和6%相比，具有显著差异（P＜0.05），此时的饮料花香与茶香搭配协调，澄清透明，滋味丰富。随着葡萄籽浸提液添加量继续增加，饮料熟闷味逐渐加重，涩味逐渐变强。综合分析，确定葡萄籽浸提液添加量为3%。
图3 葡萄籽浸提液添加量对复合饮料感官评价的影响Fig. 3 Effect of grape seed extract on sensory quality of experimental beverage
2.1.4 山楂浸提液添加量
山楂浸提液添加量对复合饮料感官评价的影响由图4可知，山楂浸提液添加量为1%感官评分最高，与0.5%和1.5%相比，具有显著差异（P＜0.05）。此时的饮料澄清透明，酸甜适口，具有复合饮料的风味。山楂浸提液添加量低于1%，饮料滋味不够丰富，整体稍显平淡。山楂浸提液添加量高于1%，饮料山楂味明显，掩盖花香，酸味突出，口感协调性下降。综合分析，确定山楂浸提液添加量为1%。
图4 山楂浸提液添加量对复合饮料感官评价的影响Fig. 4 Effect of hawthorn extract on sensory quality of experimental beverage
2.1.5 枸杞浸提液添加量
枸杞浸提液添加量对复合饮料感官评价的影响由图5可知，枸杞浸提液添加量为3%，感官评分最高，但与2%相比，不具显著差异（P＜0.05）。枸杞浸提液添加量低于3%，饮料偏苦，但整体滋味较为协调。枸杞浸提液添加量高于3%，饮料枸杞味明显，掩盖花香，且涩味明显。综合考虑，确定枸杞浸提液添加量为3%。
图5 枸杞浸提液添加量对复合饮料感官评价的影响Fig. 5 Effect of wolfberry extract on sensory quality of experimental beverage
2.2 响应面试验设计与结果
根据单因素试验的结果，以普洱茶浸提液添加量、玫瑰花冷萃液添加量、葡萄籽浸提液添加量、山楂浸提液添加量为自变量，以复合饮料的感官评分为响应值，进行4因素3水平响应面试验，研究设计及结果见表3。
通过Box-Behnken对表3中的数据进行多元回归分析，得出试验因素对感官评分之间的拟合方程为：
表3 Box-Behnken设计及结果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment
Y=-278.12+12.95A+50.72B+66.28C+62.07D-0.13AB+0.03AC+0.02AD-0.20BC-0.80BD-2.9CD-0.45A2-7.31B2-6.48C2-24.73D2。并对模型进行方差分析，分析结果见表4。从表4可知，此模型F=73.52，P＜0.000 1，回归模型极显著。失拟项F=2.76，P=0.170 3＞0.05，不显著，表明此模型与纯误差没有显著关联。决定系数R2=0.986 6，校正系数R2adj=0.973 2，说明感官评分的实测值与预测值之间具有较好的一致性，得到的回归方程适于分析和预测复合饮料的感官评分。
表4 回归模型方差分析结果Table 4 Analysis of variance on regression model
回归模型中A（普洱茶浸提液添加量）、B（玫瑰花冷萃液添加量）、C（葡萄籽浸提液添加量）、D（山楂浸提液添加量）对产品感官评分的影响极其显著（P＜0.01）。4个因素的F值表明，影响复合饮料感官评分的因素依次为A＞C＞B＞D，即普洱茶浸提液添加量对饮料感官评分的影响最大，其次是葡萄籽浸提液添加量，山楂浸提液添加量的影响最小。
2.3 响应面交互作用分析
通过回归分析得出复合饮料感官评价中各因素相互作用的响应面和等高线图，见图6-图11。根据响应面图可以观测到各影响因素之间的相互关系，响应面的斜率越大，相互作用越明显，响应面的斜率越平滑，相互作用越弱[32]。同样，等高线图也能反映各因素之间的交互作用，圆形等高线表示弱交互作用，椭圆形等高线表示强交互作用[33]。
由图6所示，普洱茶浸提液添加量与玫瑰花冷萃液添加量的交互作用对复合饮料感官评分影响呈先上升后下降的趋势，响应曲面呈弧形。以普洱茶添加量15%和玫瑰花冷萃液添加量3%，感官品质最佳。等高线近似圆形，说明普洱茶浸提液添加量与玫瑰花冷萃液添加量（AB）交互作用对复合饮料的感官评分没有明显影响。普洱茶添加过多，饮料茶味凸显，掩盖花香，造成滋味苦涩。普洱茶添加过少，饮料滋味单薄，缺乏丰富性。玫瑰花添加量过多，香味过于突出，与茶香搭配不协调，且涩味明显；
玫瑰花添加量过少，饮料香味以发酵味为主，缺乏复合饮料特征香味。由图7可知，随着普洱茶浸提液添加量和葡萄籽浸提液添加量的增多，复合饮料感官评分先增加，后减小。普洱茶添加量15%、葡萄籽浸提液添加量5%时，感官评分为85分。两因素等高线近似圆形，表明普洱茶浸提液添加量与葡萄籽浸提液添加量（AC）交互作用对复合饮料感官评分的影响不显著。葡萄籽添加过多，饮料闷熟味明显、涩味突出；
葡萄籽添加过少，饮料滋味不够饱满。由图8可知，等高线呈近圆形，表明普洱茶浸提液添加量与山楂浸提液添加量（AD）交互作用对复合饮料感官评分无明显影响。山楂添加过多，饮料酸味突出，适口性差；
山楂添加过少，饮料滋味不够丰富，稍显单薄。由图9可知，等高线呈近圆形，表明玫瑰花冷萃液添加量与葡萄籽浸提液添加量（BC）交互作用对复合饮料感官评分的影响不显著。由图10可知，等高线近似椭圆形，说明玫瑰花冷萃液添加量与山楂浸提液添加量（BD）交互作用对复合饮料感官评分的影响优于AB、AC、AD、BC，但效果仍不显著。由图11可知，葡萄籽浸提液添加量和山楂浸提液添加量等高线呈椭圆形，表明葡萄籽浸提液添加量与山楂浸提液添加量（CD）交互作用对复合饮料感官评分的影响显著。
图6 普洱茶浸提液和玫瑰花冷萃液添加量对复合饮料感官评分影响的响应曲面及等高线Fig. 6 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by Pu-erh tea extract and rose cold extract
图7 普洱茶浸提液和葡萄籽浸提液添加量对复合饮料感官评分影响的响应曲面及等高线Fig. 7 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by Pu-erh tea and grape seed extracts
图8 普洱茶浸提液和山楂浸提液添加量对复合饮料感官评分影响的响应曲面及等高线Fig. 8 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by Pu-erh tea and hawthorn extracts
图9 玫瑰花冷萃液和葡萄籽浸提液添加量对复合饮料感官评分影响的响应曲面及等高线Fig. 9 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by rose cold extract and grape seed extract
图10 玫瑰花冷萃液和山楂浸提液添加量对复合饮料感官评分影响的响应曲面及等高线Fig. 10 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by rose cold extract and hawthorn extract
图11 葡萄籽浸提液和山楂浸提液添加量对复合饮料感官评分影响的响应曲面及等高线Fig. 11 Response surface contour lines on sensory score of experimental beverage affected by grape seed and hawthorn extracts
2.4 最佳配方的确定及验证试验
经过Design-Expert 13软件分析，得出复合饮料最佳配方为普洱茶浸提液添加量14.09%，玫瑰花冷萃液添加量3.23%，葡萄籽浸提液添加量4.89%，山楂浸提液添加量0.92%，感官评分预测值为85.56分。为验证所建立多元回归模型的准确性，同时确保试验的可操作性，对配方进行如下修正：普洱茶浸提液添加量14.1%，玫瑰花冷萃液添加量3.2%，葡萄籽浸提液添加量4.9%，山楂浸提液添加量0.9%。通过3组平行试验，得到复合饮料的感官评分平均值为85.6分，接近于预测值，说明该模型具有较高的预测准确度。
2.5 质量指标检测结果
2.5.1 感官分析结果
优化后的复合饮料表现出色泽红色，均匀明亮；
状态澄清透明，无沉淀、无异物；
玫瑰花香显著，与茶香融合，无异味；
滋味酸甜适中，丰富协调。
2.5.2 理化指标与微生物指标
普洱茶玫瑰花葡萄籽复合饮料的理化指标及微生物指标如表5所示。其中复合饮料茶多酚含量为 327.75±7.10 mg·kg-1，咖啡因含量为 204.15±1.72 mg·kg-1，均符合 GB/T 21733—2008《茶饮料》中复合茶饮料规定；
微生物指标符合GB 7101—2015《饮料》中微生物限量。
表5 普洱茶玫瑰花葡萄籽复合饮料理化指标及微生物指标测定结果Table 5 Detection results of physical and chemical indexes and microbial indexes of Pu-erh tea rose grape seed compound beverage
2.6 抗氧化活性分析
普洱茶玫瑰花葡萄籽复合饮料的抗氧化活性如表6所示。其对DPPH自由基的清除能力达到65.17±1.28%，其清除ABTS自由基的能力与维生素C相当，为98.78±0.15%。
表6 普洱茶玫瑰花葡萄籽复合饮料对2种自由基的清除率Table 6 The scavenging rate of Pu-erh tea rose grape seed compound beverage against two kinds of oxygen radicals
通过单因素试验和响应面试验对普洱茶玫瑰花葡萄籽复合饮料的配方工艺进行研究，结果表明最佳配比为普洱茶浸提液添加量14.1%、玫瑰花冷萃液添加量3.2%、葡萄籽浸提液添加量4.9%、枸杞浸提液添加量3%、山楂浸提液添加量0.9%。在此配比下，复合饮料色泽红亮、澄清透明、花香显著、酸甜适中，具有良好的风味，感官评分达 85.6，茶褐素含量为 1 132.90±15.82 mg·kg-1，茶多酚含量为 327.75±7.10 mg·kg-1，咖啡因含量为204.15±1.72 mg·kg-1，没食子酸含量为 18.10±0.02 mg·kg-1，多糖含量为 214.47±1.45 mg·kg-1，黄酮含量为 39.26±1.71 mg·kg-1。DPPH 自由基清除率65.17±1.28%，ABTS自由基清除率98.78±0.15%，具有较好的抗氧化活性。
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