姚 琪,李佳寅
(嘉兴市第一医院·浙江 嘉兴 314000)
氧化应激损伤在心血管疾病的发病过程中发挥着重要作用并且受到广泛重视,研究证实氧化应激在心肌缺氧、缺血及再灌注损伤等多个病理生理过程中均有重要作用,均会引起心肌细胞的凋亡或坏死[1]。心肌细胞属于不可再生的高度分化细胞,因此如何抑制氧化应激及降低心肌细胞凋亡是研究心血管疾病的热点。橘皮素是在柑橘中第一个被发现具有大量多甲氧基黄酮的物质,在抗癌、抗炎及治疗心血管疾病中具有较好的作用[2]。近些年,其研究较为广泛,生物利用度方面位居所有多甲氧基黄酮单体中前列[3]。本研究重点探讨了橘皮素对双氧水致心肌细胞氧化损伤的保护作用及与PI3K/AKT信号通路的相关性,现报道下。
1.1 实验材料 橘皮素:Macklin公司,货号:C13883344,纯度95%;H9C2心肌细胞:上海中乔新舟生物科技。低糖DMEM培养基:Hyclone公司;胎牛血清:Gibco公司;CCK8试剂盒:Elabscience公司,货号:E-CK-A362;ROS试剂盒:南京建成公司,货号:E004-1-1;Western blot抗体:Affinity公司,PI3K(货号:AF6242)、Akt(货号:AF6261)、p-Akt(货号:AF0016)、β-actin(货号:AF7018)、羊抗兔二抗(货号:S0001)。ELX800酶标仪:BIOTEK公司,);LSR Fortessa流式细胞仪:BD公司。
1.2 橘皮素溶液的配制 采用分析天平,称取1.57 mg橘皮素,再加500 μL DMSO,充分溶解后,加9.5 mL完全培养基,用孔径0.22 μm的过滤器过滤除去细菌,母液浓度为400 μmol/L,依据预先试验结果,最终添加到细胞内的浓度为5 μmol/L。
1.3 细胞培养 H9C2心肌细胞培养于37 ℃,含5% CO2培养箱中,于低糖DMEM培养基加入10%胎牛血清,待细胞生长至80%后进行传代。
1.4 细胞分组及处理 H9C2细胞铺板后进行分组,分别为:正常组(Control):常规培养,与其他组别同步换液处理;氧化损伤组(ODG):待细胞培养密度为70%时,添加H2O2,浓度为600 μmol/L,作用时间12 h;橘皮素组(Tangeretin):在制备氧化损伤模型前,添加橘皮素5 μmol/L,作用时间12 h。
1.5 观察指标
1.5.1 CCK8实验检测细胞活力值 1)H9C2心肌细胞在对数生长期内消化,铺96孔板,每孔铺6 000细胞,培养24 h;2) 分别对3组细胞进行换液或加药处理, ODG组建立氧化损伤模型,橘皮素组采用橘皮素5 μ mol/L预先处理12 h;3)将10 uL CCK8溶液加入每孔中;4)使用酶标仪设定检测波长450 nm,并测量各组的吸光度值;5) 计算细胞活力值,细胞活力值=(实验组OD值-空白孔OD值)/(Control组OD值-空白孔OD值)×100%。
1.5.2 流式细胞术检测细胞ROS表达 细胞接种于6孔板,经相应处理后,将DCFH-DA (10 μ mol/L)加入6孔板,37 ℃培养30 min, PBS清洗3次,导入流式细胞仪测定细胞内 ROS。
1.5.3 Western blot检测各组PI3K/Akt通路蛋白的表达 3组细胞经 PBS浸润清洗后置于冰上,加入 RIPA裂解液提取蛋白,通过BCA法测定蛋白浓度,调整浓度,加入3×loading buffer,95 ℃变性5 min,制分离胶和浓缩胶,蛋白电泳,转膜,加入BSA室温摇床封闭2 h, PBS洗膜后4 ℃摇床上孵育一抗PI3K(1∶1 000)、P-Akt(1∶1 000)、 Akt(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、孵育时长12 h,洗膜后室温下孵育辣根过氧化物酶标记的二抗2 h,PBS充分清洗后显影。
2.1 各组细胞活性比较 见表1。
表1 各组细胞活力值比较
2.2 各组细胞内ROS表达量的比较分析 见图1。
注:与Control组比较,*P<0.05;与ODG组比较,#P<0.05
2.3 各组细胞PI3K/Akt通路蛋白表达的Western blot检测结果 见图2。
注:与 Control组比较,*P<0.05;与ODG组比较,#P<0.05
橘皮素属于天然多甲氧基黄酮的一种,主要提取于柑橘果皮[4]。柑橘果皮也称为陈皮,属于传统中药,主要功效为燥湿化痰、理气健脾。现代医学证实:陈皮在防治动脉粥样硬化中具有较好的疗效[5-6]。橘皮素为弱极性,具有疏水性,分子量较低,分子式为C20H20O7,其特性易于通过细胞膜的磷脂双分子层,从而进入细胞内发挥其药理作用[7]。此外,橘皮素相较于目前已报道的黄烷酮类单体具有更好的口服吸收利用率与生物利用率,目前已证实在保护神经元、降血压、抗癌、抗炎等方面均有作用[7-8],因此其生物活性与结构特征均受到科研工作者的普遍关注。本研究重点探讨了橘皮素对于心肌细胞氧化损伤的保护作用及与ROS表达及PI3K/Akt信号通路的相关作用。
双氧水是ROS表达的诱导剂,经常用于各类细胞的氧化应激研究[9],当线粒体产生过多的ROS后,机体就会产生应激反应,导致 DNA、蛋白质、脂质过氧化、抗氧化酶活性降低,从而损伤细胞[10]。PI3K/Akt信号可由ROS的表达而激活,ROS在其中发挥了第二信使的作用[11]。内源性抗氧化剂的消耗与氧化应激的增加均会引起心肌细胞的损伤与凋亡,PI3K属于细胞质脂类激酶,PI3K通路中的Akt为关键激酶。PI3K属于异二聚体,由催化亚基p110和调节亚基p85组成,PI3K磷酸化的同时会生成磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP3),招募并引起Akt磷酸化,调控了氧化应激、凋亡、生长等多种生理活动,在心血管疾病中起到了关键作用[12-13]。
研究证实:激活PI3K/Akt信号通路能有效抑制心肌细胞氧化应激,减少心肌细胞凋亡,同时心梗面积也得到有效控制[14-15]。此外,激活PI3K/Akt信号通路对H9C2心肌细胞凋亡有明显的抑制作用,同时PI3K抑制剂LY294002可以阻断H9C2心肌细胞的氧化应激损伤[16-17]。基于上述理论,本研究首先构建H9C2氧化损伤心肌细胞,经5μmol/L橘皮素预处理,证实橘皮素对H9C2心肌细胞氧化损伤有明显的保护作用,流式细胞仪检测显示橘皮素对ROS表达有明显的抑制作用。同时, Western blot也证实,橘皮素预处理能有效促进PI3K/Akt通路激活。
综合上述:橘皮素预处理可有效发挥对双氧水致心肌细胞氧化损伤的保护作用,其机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活相关。
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