刘海林，李杰，吴沙沙，叶广英，孙世利，王再花
（1广东省农业科学院环境园艺研究所/广东省园林花卉种质创新综合利用重点实验室，广州 510640；
2福建农林大学风景园林与艺术学院/兰科植物保护与利用国家林业和草原局重点实验室/福建省观赏植物种质资源创新与应用工程技术研究中心，福州 350002；
3广东省农业科学院茶叶研究所，广州 510640）
金钗石斛(Dendrobium nobile)为兰科石斛属植物，作为中国传统名贵中药材之一，早已被列入《中华人民共和国药典》[1]，其含有的石斛碱、多糖、黄酮类等活性物质，不仅具有提高免疫力、抗肿瘤、降血糖、滋阴清热等功效，还对心血管、白内障、胃肠道和呼吸系统等疾病具有较好疗效[2-5]。同时，金钗石斛因花色艳丽，形态优美，花期长，观赏价值极高，深受人们喜爱，市场开发前景好[6]。但近年来乱采滥挖现象突出，金钗石斛生境遭受严重破坏，野生资源日渐稀少，已难以满足市场需求。目前，金钗石斛栽培方式以仿野生栽培和设施栽培为主[7]。设施栽培具有环境条件可控、繁育快、产量高等优势，是开发金钗石斛资源、解决药材来源紧缺及实现其园林观赏价值的有效途径。在生产栽培中，氮素为植物生长发育的重要营养元素之一[8]，一旦氮素营养失衡，将直接影响作物的产量及品质[9]。掌握金钗石斛的营养传输分配规律、了解氮素水平对其生长和品质的影响，对指导生产具有重要意义。前人在金钗石斛组培繁育、种植管理、化学成分和药理等方面已做了大量研究，其中种植管理方面主要是大田栽种、无土栽培、组培苗移栽、原生态栽培方法和技术及病虫害防治等方面[5,10-17]。而温室设施栽培中，供氮水平对金钗石斛生长和品质影响的研究报道不多，营养元素被吸收后在不同年生假鳞茎（简称茎，下同）以及不同部位（茎、叶、根）间转运和分配规律如何尚未见报道。为探究上述问题，本研究以金钗石斛3年生苗为材料，测定不同供氮水平施肥处理下不同时期的形态指标变化和N、P、K元素含量变化，并比较分析不同处理间石斛碱含量以及开花情况，解析不同供氮水平对金钗石斛生长、品质的影响以及营养元素在植株体内的转运规律，旨在为石斛精准设施栽培和品质提升提供理论指导。
1.1 试验时间、地点
试验于2020年4月—2021年6月在广东省农业科学院环境园艺研究所白云区基地进行。
1.2 试验材料
供试材料为生长健康且长势一致的金钗石斛3年生苗，含高约10 cm 的1 年生茎、2 年生和3 年生老茎（图1），用上口径8 cm、下口径5.4 cm、高8 cm 的营养杯种植，栽培基质为松树皮:椰糠（体积比6:4），置于60 cm 高的温室苗床。温室设施内年平均气温22.67℃，相对湿度79.67%。夏秋季遮荫70%～80%，其他季节遮荫50%～60%。
图1 金钗石斛3年生苗形态特征
1.3 试验方法
1.3.1 不同氮素水平的处理
（1）营养液配制。氮元素含量设CK（对照，喷施清水）、1/2N、1N和2N 4个梯度，每个梯度作为一个处理，共4 个处理。参考Hoagland’s（霍格兰氏）营养液配方，具体如下。①1/2N母液：称取Ca(NO3)247.23 g，CaCl266.6 g，KNO3101.2 g，NH4NO316 g，加水定容至1 L即为200倍母液。②1N母液：称取Ca(NO3)2189 g，KNO3101.2 g，NH4NO316 g，加水定容至1 L 即为200倍母液。③2N母液：称取Ca(NO3)2378 g，KNO3202.4 g，NH4NO332 g，加水定容至1 L 即为200 倍母液。④KH2PO4母液：称取KH2PO413.6 g，加水定容至1 L即为100倍母液。⑤MgSO4·7H2O母液：称取MgSO443.9 g，加水定容至1 L即为100倍母液。⑥铁盐、微量元素参照Hoagland’s营养液配方，分别配制1000、5000倍母液。
（2）施肥方法。吸取任一氮素梯度母液5 mL，KH2PO4母液1 mL，MgSO4·7H2O 母液1 mL，铁盐母液1 mL，微量元素母液0.2 mL，加水定容至1 L，即为1 L营养液。每周均匀喷施根和叶面1次，喷至杯底刚刚滴水为止。每次喷施每个处理施用的营养液总量相等。
（3）样品的制备。每处理各240杯苗，每个营养杯种植1 株苗（如图1），分别于2020 年4 月30 日、6 月30日、8 月31 日、10 月31 日、12 月31 日和2021 年2 月28日、4 月30 日从各处理中随机选取30 杯苗用于试验，期间破坏性取样，共7批次，测定不同部位N、P、K含量和石斛碱含量及单株干重。另外，固定长势一致、均匀的30杯苗不进行取样，仅用于生长性状的观测。采集来的各处理1年生茎、1年生茎的叶片、根、2年生茎和3年生茎，经烘箱105℃杀青30 min，60℃烘干至恒重，然后粉碎过60目筛，装入密封袋，4℃冰箱保存待测。
1.3.2 形态指标和开花性状观测由于金钗石斛植株3年生茎和2年生茎已停止生长，因此仅对1年生茎进行形态指标测量。用于形态测定的30株固定苗分为3个重复，每个重复10杯苗，自2020年4月30日开始，每月定期测定并统计植株茎的平均茎高、平均茎粗、平均茎节数和平均叶片数。因3年生茎不开花、2年生茎开花数量少，因此开花统计对象为1年生茎。在开花期间，观察和统计不同处理的平均单株开花节数和平均单株花朵数，评价开花品质。
1.3.3 植株与栽培基质的N、P、K 含量测定每10 棵苗合并为一个重复，3 次重复。全氮含量检测参照LY/T 1269—1999（3.2 蒸馏法），磷含量检测参照GB 5009.87—2016，钾含量检测参照GB 5009.91—2017。
1.3.4 石斛碱含量测定
（1）样品提取。参照《中华人民共和国药典》[1]石斛项下金钗石斛石斛碱含量检测方法进行改良，精确称取样品粉末0.1250 g，置于125 mL 三角瓶，加入含有0.05%甲酸的甲醇，封口膜封口，摇匀，放入超声波水浴锅中，采用常温超声辅助提取30 min，使用一次注射器吸取1.5 mL上清液经0.22 μm微孔滤头过滤并注入2 mL进样瓶中，准备上机检测。
（2）石斛碱含量检测。利用日本岛津气相色谱质谱联用仪（型号GCMS-QP2020NX）检测样品。色谱条件：柱温80℃（保留1 min），以10℃/min 升温至230℃，运行时间2 min，以5℃/min 升温至250℃；
进样口温度250℃，分流比1:1，柱流量1.48 mL/min，柱前压100 kPa，进样量1 μL；
载气为高纯度氦气(99.99%)。质谱条件：电离方式EI；
离子源温度230℃；
接口温度250℃；
溶剂延迟时间1 min；
检测器电压0.1 kV；
采集方式Scan；
质量范围35～300m/z[18]。
（3）石斛碱标准曲线配制。精确称取石斛碱标准品（购于上海安谱试验科技股份有限公司）5 mg 溶于250 mL甲醇中，配成浓度为20 μg/mL的母液，分别吸取7.5、2.5、1.0、0.5、0.25 mL，加入甲醇分别定容至10 mL，浓度分别为15.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/mL，上机检测石斛碱含量，绘制标准曲线y=2691777.8x+1250403.55，其中，y为石斛碱检测峰面积，x为样品浓度。
1.4 数据分析
利用Excel 2010 对试验数据进行整理和作图，利用SPSS 23.0进行统计分析(P＜0.05)。
2.1 供氮水平对金钗石斛生长和开花的影响
不同供氮水平处理下，金钗石斛1 年生茎的平均茎高、茎粗、茎节数、叶片数等指标均优于对照（图2），表明施氮有利于植株生长，9 月底植株休止叶形成后逐渐停止生长。11月30日以后植株茎高、茎节数基本无变化，茎粗和叶数逐渐减少。除茎粗外，其他形态指标在不同处理间的差异均不显著，茎粗则以1/2N处理最大。
图2 1年生茎形态指标变化情况
6—9 月天气干燥炎热，日照强烈，金钗石斛植株进入夏季休眠期，生长受到一定的抑制，植株部分叶片脱落，茎失水快引起皱缩等，使茎粗、叶数出现较大波动。次年3 月花期到来以及长出新芽，植株部分营养转移至新芽，可能是导致1 年生茎粗持续降低的原因（图2）。
植株地上部的干重总体上是逐步增加的，3 种不同氮水平施肥处理显著优于对照。对比不同处理，2020 年4 月30 日—2021 年4 月30 日地上部平均单株干重增量最大的是1/2N 处理(Δm=1.38 g)，其次是1N(1.30 g)、2N(1.16 g)、CK(0.62 g)，不同处理间差异不显著。4—10 月地上部干物质量逐渐增加，次年2—4 月干重又迅速增加。2021 年12 月底到次年2 月底干重短暂下降可能与抵御冬季低温、促新芽萌发，体内糖、蛋白等物质转化为能量消耗有关（图3）。
图3 不同处理平均单株干重随时间变化情况
在开花品质方面，施氮处理的开花情况优于对照，1/2N 处理的平均单株开花节数(2.4)和平均单株花朵数(4.5)优于其他处理，但与1N 处理(2、3.8)无显著差异，其次是2N(1.4、2.6)处理（图4A），效果最差为CK处理。不同处理的开花情况对比见图4B。
图4 不同氮素水平处理的开花情况对比
2.2 供氮水平对金钗石斛氮元素吸收分布的影响
由图5 可知，4 种供氮水平下，氮含量在金钗石斛苗不同部位的分布规律相似，均为1 年生茎的叶片氮含量最高，远高于其他部位。在4—8月的营养生长阶段，叶片中氮含量呈上升趋势，且1/2N、1N 和2N 处理在8 月底达到最大值(19.98～22.07 g/kg)，而后下降，而CK处理则在10月底含量最高(20.69 g/kg)。氮含量在1 年生茎、2 年生茎、3 年生茎及根中呈下降趋势，但整体上呈现1年生茎的氮含量(8.71 g/kg)要高于2年生茎(7.20 g/kg)和3年生茎(6.93 g/kg)，而在次年的2—4月，根中的氮含量则显著高于2 年生茎和3 年生茎。3 因素（不同部位、时间、处理）多水平方差分析也表明，金钗石斛不同部位氮含量均差异显著，为叶＞1 年生茎＞根＞2年生茎＞3年生茎，说明氮营养元素存在从老茎向新生茎转移的趋势。在总氮含量方面，CK、1/2N和2N处理间差异不显著，但均显著高于1N处理。
图5 不同供氮水平下金钗石斛氮元素吸收分布规律
2.3 供氮水平对金钗石斛磷元素吸收分布的影响
不同供氮水平下，磷元素含量在金钗石斛苗的不同部位也呈现与氮元素相似的分布规律（图6）。1 年生茎、2年生茎、3年生茎、叶和根均在6月底—12月底期间出现了一个磷含量上升的高峰，且在8 月底达到最大值(7.88～8.60 g/kg)，期间1年生茎的磷含量远高于其他部位，其次是叶片。3因素多水平方差分析表明，除2年生茎和3年生茎的磷含量较低且无显著差异外，其他部位均差异显著，为1 年生茎＞叶＞根。磷含量在4—6月无显著变化，但8月则显著上升至最大值，而后逐步显著下降。在总磷含量方面，CK 和1/2N 处理间差异不显著，但显著高于1N和2N处理。
图6 不同供氮水平下金钗石斛磷元素吸收分布规律
2.4 供氮水平对金钗石斛钾元素吸收分布的影响
钾含量在金钗石斛不同部位的分布规律如图7所示。叶片中的钾含量较高，除1/2N 处理外，叶片中钾含量在4—10月逐渐升高，10月底达到最大值(33.61～37.79 g/kg)，而后下降。1 年生茎中的钾含量也呈动态变化，1/2N 和1N 处理在6 月底达到最大值(35.91、26.30 g/kg)，而CK 和2N 处理则在4 月底含量最高，呈先降后升再降的趋势。同时，4 个供氮水平下，2 年生茎和3 年生茎的钾含量始终维持在较低的水平，甚至低于根中的钾含量；
根的钾含量在6 月底—10 月底呈上升的趋势，而后含量维持相对稳定。3 因素多水平方差分析表明，2年生茎和3年生茎的钾含量无显著差异，且显著低于其他部位，而其他部位均差异显著，为叶＞1 年生茎＞根。植株的钾含量整体上从4—10 月显著升高，而后至次年4 月则呈显著下降。在总钾含量方面，1/2N 处理显著高于其他处理，CK 和1N 处理次之且两者间差异不显著。
图7 不同供氮水平下金钗石斛钾元素吸收分布规律
2.5 供氮水平对地上部分与地下部分元素比值的影响
以同一元素在茎和叶中的含量之和与根中该元素含量的比值计算地上部分与地下部分元素含量的比值，了解不同供氮水平与地上部分与地下部分元素比值的相关性。由表1 可以看出，金钗石斛地上部分与地下部分氮元素比值在4—6月显著上升，在6月底平均比值最高，达6.56，而后逐渐显著下降至次年4月底的4.61。供氮水平间，1/2N处理的平均比值最高，但与2N处理和CK差异不显著。
表1 不同供氮水平下金钗石斛地上部分与地下部分氮比值
地上部分与地下部分磷元素比值在4 月底和6月底的平均比值分别为7.17和7.10，两者无显著差异；
虽然6—12月金钗石斛各部位的磷含量水平出现了一个显著上升的峰值，但地上部分与地下部分磷元素比值则依然呈显著下降趋势，至次年4月底已下降约一半，而不同供氮水平对磷元素比值无显著影响（表2）。
表2 不同供氮水平下金钗石斛地上部分与地下部分磷元素比值
地上部分与地下部分钾元素比值与氮元素比值的变化趋势相同，钾元素平均比值由4 月底的9.06 显著升高至6 月底的10.98，随后逐渐显著下降至次年4月的3.10。不同供氮水平处理下，1/2N 处理的钾元素平均比值(7.17)显著高于其他处理，而CK 处理最低(6.24)（表3）。
表3 不同供氮水平下金钗石斛地上部分与地下部分钾元素比值
2.6 供氮水平对金钗石斛石斛碱含量的影响
12 月底对各处理的金钗石斛进行石斛碱含量测定，发现不同处理间、同一处理的不同部位（茎、叶、根）间均存在显著差异（图8，表4）。施氮处理植株不同部位的石斛碱含量均高于对照，其中茎、叶差异显著，根不显著。整体上，茎中石斛碱含量明显高于叶和根，3年生和2年生茎中石斛碱的含量随着供氮水平的增加而减少，1 年生茎中以及叶、根中则表现相反的规律，且2N 处理下的含量最高，分别为0.77%、0.54%、0.07%。不同处理的植株茎中石斛碱含量均大于0.4%，符合药典标准；
而根、叶的石斛碱测定结果显示，除2N 处理的叶片具有较高含量的石斛碱(0.54%)外，其他处理的根和叶中石斛碱含量均低于0.4%。
表4 不同供氮水平下金钗石斛同一处理不同部位间石斛碱含量差异%
图8 不同供氮水平下金钗石斛同一部位不同处理间石斛碱含量差异
3.1 金钗石斛N、P、K元素含量变化与分配
根据金钗石斛不同部位氮含量检测结果可知，不同供氮水平下氮元素含量变化规律基本一致。1年生茎的叶片中氮含量最高，远高于其他部位。氮含量在1 年生茎、2 年生茎、3 年生茎和根中均呈下降趋势，但整体上1年生茎的氮含量显著高于2、3年生茎，说明为满足植株生长的需求，氮元素更多地向幼嫩茎叶部位转移。因此，4—8月是金钗石斛营养生长阶段，1年生茎叶片和茎处于高需氮状态，此时生产上应增加氮肥的施用。9月金钗石斛1年生茎叶生长逐渐停止，休止叶形成，对氮素需求减少，氮含量开始下降。次年2—4月，根中氮含量虽小于叶片但显著高于地上部的茎，可能与地上部处于休眠期，代谢相对减慢有关，3—4月新芽萌发，此时需要大量氮元素，也加快了根部对氮素的吸收和积累。
植物体内磷元素的分布受供磷水平的影响。当植株缺磷时，根保留其所吸收的大部分磷，地上部发育所需的磷主要靠茎叶中磷的再利用；
当植株供磷适宜，根则只保留其所吸收磷的一小部分，大部分磷转运到地上部，茎叶中的大部分磷可在生殖器官发育时转移和再利用[19]。本研究施用的是植物栽培试验中常见的改良霍格兰营养液，因此植株没有缺磷状况，供磷适宜。在不同供氮水平下，金钗石斛苗的不同部位磷元素含量呈现与氮素相似的分布规律（图5～6）。但6 月底—12 月底期间出现了一个磷含量上升的高峰期，且在8月底达到最大值，在1年生茎中磷含量升高尤为明显，且高于叶片。说明这一阶段，1年生茎需磷较多，根部吸收的大部分磷元素转移到茎和叶片中。可见，在金钗石斛生产过程中，植株由营养生长转向生殖生长时，可以适当增加磷肥的施用，以促进茎的膨大和成熟。
钾在植物体内以离子形式存在，随着植株生长，不断向代谢作用旺盛的部位转移。幼嫩茎叶和根尖等部位钾元素含量丰富，在植物整个生育期中，营养生长期对钾元素的吸收最多[20]。从金钗石斛苗的不同部位钾含量的分布情况可知，4—10 月是金钗石斛的营养生长期，茎、叶片中钾含量逐渐升高，有利于促进光合作用和加速体内营养物质的积累以及干重的增加，10月底钾含量达到最大值，此时金钗石斛也基本停止生长，之后钾含量开始下降。可见，金钗石斛在营养生长阶段对钾的需求量较大，以利于自身营养成分的积累。1年生茎中的钾含量的动态变化，表明不同供氮水平可能影响到植株的活跃状态，进而影响了钾元素在体内的分配和分布。不同处理下，2年和3年生茎的钾含量始终维持着较低的水平，甚至低于根中的钾含量，进一步表明2年和3年老茎的代谢活动弱，除自身维持足够的钾元素外，更多钾元素转移分配到生长活跃的部位。根中钾含量在6月底—10月底呈上升的趋势，表明此时期的根系代谢可能相对活跃。
关于地上部分与地下部分营养元素比值的变化，结果显示4—6 月金钗石斛地上部分与地下部分氮元素比值显著上升，表明氮素更多地分配和供应地上部分的生长，这与金钗石斛的快速生长期的营养需求特性一致。随后地上部生长速度减慢，氮元素比值逐渐下降。在低供氮水平（1/2N 处理）下，由于生长需求，氮池分配更多氮素到地上部后，地下部无盈余或盈余少，使平均比值增大，而高供氮水平或氮亏（2N处理和CK）情况下，地上部和地下部含有的氮素都充裕或都匮乏，使平均比值差异不显著。尽管因生理需求等原因，6—12 月金钗石斛各部位的磷含量出现短暂的显著升高，茎叶中积累了较多的磷元素，但地上部分与地下部分磷元素比值依然呈显著下降趋势，可能是因为9 月之后植物茎叶生长逐渐停止，对磷元素的需求减少，加之部分叶片衰老和凋落，使得地上部的磷含量减少。同理，这可能也是导致生长后期地上部分与地下部分钾元素比值降低的原因之一。
3.2 不同供氮水平对金钗石斛生长和品质的影响
尽管试验所用的栽培基质会提供少量营养供金钗石斛生长，但其营养转化速度慢、可利用效率不高，因此，本试验后期观察到CK处理中多数植株的2年生茎和3年生茎瘦瘪，部分皱缩，1年生茎生长瘦弱，叶片发黄，开花植株少，表明植株得不到足够的营养供应。而2N处理的植株叶色深绿，植株粗壮，茎饱满，尽管大部分植株开花但是花朵数少，花期迟于其他处理，与已有报道的高氮供应会使春石斛止叶形成滞后，开花延迟[21-22]的结论一致。刘晓青等[23]认为春石斛花期适当减少氮素供应，有利于提高开花量。本研究也得到1/2N和1N 处理的开花品质优于2N 处理，说明生产过程中适当减氮有利于金钗石斛开花品质的提升。
石斛碱是金钗石斛重要活性物质和主要药用成分，占总生物碱含量的92%以上，是评价金钗石斛品质的重要指标[24]。杨立昌等[25]对贵州、云南、四川产金钗石斛的生物碱含量进行测定，认为野外栽培和温室载培对金钗石斛生物碱含量并无影响。本研究采用温室设施栽培，金钗石斛茎石斛碱含量均达到药典标准，表明采用温室栽培也可获得较好的品质。此外，不同产地或不同部位金钗石斛的石斛碱含量有所不同[26-27]。本研究选用的金钗石斛为云南野生苗自交种子繁育而来的组培苗，在广州栽种后，发现在2N水平下，金钗石斛1 年生茎的叶中石斛碱含量达0.54%，符合药典标准，可作药用材料。除根外，金钗石斛地上部1～3年不同年龄茎石斛碱的含量均在0.4%以上，在一定程度上反映出本研究材料品质优良，适合当地栽培。不同生长时期石斛碱的含量也有差异。多数报道金钗石斛在12 月石斛碱含量最高，如蔡莉等[28]报道贵州赤水2 年生金钗石斛茎中石斛碱含量在12 月最高(0.64%～0.7%)，8、9 月最低。合江金钗石斛2 年生茎中石斛碱含量在12月最高，为0.51%[29]。因此，本研究也选用12月底采集的样品进行石斛碱测定，发现同一供氮水平下1 年生茎叶中石斛碱含量均最高，且含量随氮素水平增加而升高。
此外，不同年份金钗石斛石斛碱含量也存在差异，一些学者[29-31]报道了不同产地的金钗石斛茎中的石斛碱含量为1年生＞2年生＞3年生或多年生，但本研究1/2N处理和1N处理的2年生茎石斛碱含量＞1年生茎＞3年生茎，可能是幼嫩组织产生的石斛碱和植株叶片脱落前自身石斛碱向贮藏器官茎转移所导致的[32]。本研究2N处理下石斛碱含量1年生茎＞2年生茎＞3年生茎，可能是高氮使得1年生茎生长期延长，石斛碱仍在向幼嫩组织中转移[32]，在实际观察中也发现2N处理的1 年生茎叶色鲜绿，休止叶的形成较其他处理晚。目前，氮素对药用植物体内生物碱累积的影响研究得到的结论并不一致。孙世芹等[33]报道氮素过多或过少均不利于植物中生物碱的合成和累积，而施晟璐等[34]则发现菘蓝在低氮胁迫下能合成更多的生物碱。本研究CK 和1/2N 处理的茎中石斛碱含量均较高（符合药典标准），出现类似施晟璐等[34]报道的低氮营养下的情况，其原因尚不明确。整体来看，本研究金钗石斛茎中石斛碱含量高于叶片，而根的含量最低。3年生和2年生茎中石斛碱的含量随氮水平的增加而降低，而在1年生茎、根和叶中则呈现相反的趋势。对于供氮水平对金钗石斛石斛碱合成的影响及分布规律仍有待进一步研究。
不同供氮水平下，金钗石斛在生长过程中各器官氮、磷、钾元素含量变化规律基本一致，生长期含量逐渐升高，至8—10 月达到最高，生殖期则逐渐下降，至次年开花期达到最低。不同器官则以生长活跃的1年生叶、茎中氮、磷、钾含量更高，老年茎含量较低，可见为满足植株生长的需求，营养元素优先向幼嫩茎叶转移。此外，金钗石斛生长发育过程中，营养生长对氮、磷、钾肥需求较大；
随着植株由营养生长转向生殖生长，可适当增加磷肥的施用，以促进假鳞茎的膨大和成熟；
当植株生长逐渐停止进入生殖生长期时，对钾需求较大，增施钾肥有利于营养成分的积累。施氮有助于石斛碱含量的增加，提高药用品质，而1/2N和1N处理的开花品质相对较优。本研究结果可为金钗石斛设施栽培和生产提供一定指导。