郝芳敏 臧全宇 丁伟红 马二磊 黄芸萍 王毓洪
摘 要：由镰刀菌属引起的甜瓜果腐病是全球甜瓜生产的重要真菌性病害之一，2020年从浙江宁海发病甜瓜上分离获得一株亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum）Fa-25，可引起浙江省的甜瓜果腐病，为明确该亚洲镰刀菌的生物学特性，开展Fa-25的最适生长条件和致病力的探究。结果表明，亚洲镰刀菌Fa-25的最适生长温度为28 ℃，比较适合的碳源为葡萄糖和乳糖，比较适合的氮源为KNO3、甘氨酸、亮氨酸和丙氨酸，尿素则不利于生长。该病原菌喜光，菌丝致死温度为35 ℃，最适的pH为6。利用亚洲镰刀菌Fa-25对瓜类果实进行刺伤接种，筛选到柏格、HXC12和P80这3个较抗的甜瓜材料。此外，Fa-25还可对西瓜和黄瓜产生致病力。
关键词：甜瓜；
果腐病；
亚洲镰刀菌；
生物学特性；
刺伤接种
中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）06-016-07
Biological characteristics of a new pathogen Fusarium asiaticum causing melon fruit Fusarium rot and selection of disease-resistant varieties
HAO Fangmin， ZANG Quanyu， DING Weihong， MA Erlei， HUANG Yunping， WANG Yuhong
（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， Zhejiang， China）
Abstract：
Melon fruit rot caused by Fusarium is one of the most important fungal diseases worldwide. In this study， a strain of Fusarium asiaticum Fa-25 was isolated from melon infected in Ninghai in 2020， which can cause melon fruit rot in Zhejiang Province， we studied the biological characteristics of this F. asiaticum Fa-25， the result shows that Fa-25 is suitable for cultivation in light environment， the optimum culture temperature of F. asiaticum was 28 ℃， the lethal temperature was 35 ℃， and pH 6 is the best. Glucose， lactose and raffinose were the best carbon sources， KNO3， glycine， leucine and alanine could be used as nitrogen sources， while urea was not conducive to growth. Fa-25 was inoculated by stab wound， and three resistant muskmelon materials were screened， including Berg， HXC12 and P80. In addition， Fa-25 could also cause virulence to watermelons and cucumbers.
Key words：
Melon; Fruit rot; Fusarium asiaticum; Biological characteristics; Stab wound inoculation
甜瓜是全球性的重要园艺作物，在全球的栽培选育过程中，面临着枯萎病、蔓枯病、白粉病、霜霉病、根腐病和细菌性果斑病等多种病害的威胁，严重影响甜瓜的产量和品质。其中细菌性果斑病可危害甜瓜果实，是一种细菌性病害，发病初期病斑只存在于果实表面，随后病菌开始向果实内部侵染，造成果肉腐烂[1-2]。由镰刀菌属（Fusarium spp.）引起的甜瓜果腐病是全球甜瓜生产的重要真菌性病害之一。多危害半成熟和成熟的果实，发病初期果实呈水渍状病斑，后期内部开始腐烂，病部长出白色或粉红色霉层[3-4]。该病害初期不易被发现，不能够及时进行防治，一旦发生，果实出现腐烂，严重影响果实的品质和产量，对整个甜瓜产业造成极大的损失。同时镰刀菌可分泌多种毒素，人畜误食会中毒，因此该病一旦发生就是毁灭性的。不同品种间抗性存在差异，选育抗病品种是防治甜瓜果腐病最主要的方式之一。
筆者在2019年陆续在浙江宁海、宁波本地等多个田块鉴定到由亚洲镰刀菌（F．asiaticum）引起的甜瓜果腐病，均发生在甜瓜成熟后期，发病率高达70%，部分田块甚至出现绝产，严重制约甜瓜产业的发展，这也是全球范围内首次报道由亚洲镰刀菌（F．asiaticum）引起的甜瓜果腐病[5]。由于镰刀菌普遍存在于土壤中，而甜瓜的种植，大部分采用爬地栽培，果实与土壤的接触不可避免，另一方面，网纹甜瓜在网纹形成时，会出现大量裂瓜现象，很容易被镰刀菌感染。引起甜瓜果腐病的镰刀菌种类很多，包括木贼镰刀菌（F. equiseti）、砖红镰刀菌（F. lateritium）、变红镰刀菌（F. incarnatum）、F. falciforme，F. sulawesiense、F. pernambucanum、F. kalimantanense、F. nanum和F. luffae等[4，6-8]。因此笔者开展亚洲镰刀菌（F. asiaticum）的生物学特性研究以及筛选抗该病害的甜瓜品种，以期为该病害发生规律的研究及其防控提供理论依据，有效减少甜瓜果腐病的发生，促进农业增产增收，对甜瓜产业的可持续发展起到技术支撑作用。
1 材料方法
1.1 供试菌株和培养基
供试病原菌：亚洲镰刀菌Fa-25于2020年从浙江省宁海市腐烂的甜瓜果实表面上分离获得[5]，在 PDA 培养基上进行活化，作为供试菌株。
马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL，121 ℃灭菌 20 min。察式培养基（Czapeks medium）：硝酸钠（NaNO3） 3.00 g、磷酸氢二钾（K2HPO4） 1.00 g、硫酸镁（MgSO4·7H2O） 0.50 g、 氯化钾（KCl） 0.50 g、硫酸亚铁（FeSO4）0.01 g、蔗糖 30.00 g、琼脂 15.00 g ，蒸馏水 1000 mL，调pH至7.3，121 ℃灭菌 20 min。
1.2 供试甜瓜、西瓜和黄瓜品种
笔者所用的厚皮甜瓜材料和品种为2926、ZHT-9、LB2、P60、P51、柏格、西州密25號、P59、CX5-5、CX5-4、P80、翠蜜6号、P42、Gsh-1和HXC12；
薄皮甜瓜材料和品种为鲜脆1号、21c23、21c56、21c32、21c43、21c18、21c31、21c44、21c24和翡翠绿宝；
西瓜材料和品种为东城佳美、卓越16号、22W-37、兰芯、22XB-18、22XB-22和22XB-5；
黄瓜材料和品种为HS×DM、津优1号、土×HS、JY4×土和碧翠20。其中，柏格为上海惠和种业有限公司提供，西州密25号为新疆葡萄瓜果开发研究中心提供，翠蜜6号、卓越16号为安徽江淮园艺种业股份有限公司提供，津优1号为天津市黄瓜研究所提供，碧翠20为浙江勿忘农种业科学研究院提供，其他品种均由宁波市农业科学研究院提供。
1.3 生物学特性研究
设置不同温度、不同光照时间、不同碳源、不同氮源及不同pH值对病原菌菌丝生长、产孢量的影响，明确甜瓜果腐病病原菌亚洲镰刀菌Fa-25的生物学特性。
1.3.1 温度对Fa-25生长速度和产孢量的影响 所用培养基为PDA培养基，设置5、15、20、25、28、30、35 ℃共7个温度处理并于黑暗中培养。
1.3.2 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 PDA培养基中的葡萄糖用等质量的蔗糖、乳糖、木糖、菊糖、棉子糖、可溶性淀粉等不同碳源替换，制成不同碳源的固体培养基于黑暗中培养。
1.3.3 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 察式培养基中的硝酸钠用等量的尿素、甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸和硝酸钾等替换，制成不同氮源的固体培养基于黑暗中培养。
1.3.4 不同光照对病原菌菌丝生长的影响 所用培养基为PDA培养基，分别于光照24 h·d-1、黑暗24 h·d-1、光照12 h·d-1和黑暗12 h·d-1进行培养。
1.3.5 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 对PDA培养基用PBS缓冲液设定 pH为5、6、8和10共4个处理，制成不同pH的固体培养基于黑暗中培养。
生长速度的测定：用灭菌的打孔器（6 mm）取菌饼，分别于上述条件下培养，3次重复，每个重复5皿，十字交叉法测量菌落直径。菌丝生长速度=（48 h所测病斑直径-24 h所测病斑直径）/2。
1.4 抗病品种的筛选
将供试菌株亚洲镰刀菌Fa-25置于PDA平板上于28 ℃的恒温箱中培养2～3 d，用灭菌的打孔器（直径6 mm）在供试菌株菌落边缘打取菌块，用消毒的牙签在果实（厚皮甜瓜，薄皮甜瓜、西瓜，黄瓜）上刺伤，并将菌块接种到果实上，然后放置于铺有湿润吸水纸的塑料盆中，不含有菌丝的琼脂块接种作为CK，3次重复，每个重复3个果实，每个果实上接种1个菌丝块。用保鲜膜覆盖接种盆，将接种盘置于28 ℃下培养，8 d后测量果实接种块周围的病斑直径，采用软件graphpad prism 9进行方差分析。
2 结果与分析
2.1 病菌生物学特性测定
2.1.1 不同温度对病原菌菌丝生长的影响 由图1可知，亚洲镰刀菌Fa-25的气生菌丝为白色，生长致密，菌落边缘较整齐，背面为粉红色（图1-a）。菌丝适宜的生长温度为20～28 ℃，以28 ℃最适，生长速度为10.56 mm·d-1，在30 ℃条件下可以缓慢生长，而在35 ℃培养时，菌丝无法生长（图1-b）。
2.1.2 不同碳源对病原菌菌丝生长的影响 由图2可知，Fa-25可在供试的7种碳源进行培养，可利用多种碳源促进生长（图2-a），其中在含有葡萄糖（11.85 mm·d-1）和乳糖（11.05 mm·d-1）的培养基上生长差异不显著，但是在含有蔗糖、木糖、菊糖、可溶性淀粉和棉子糖的培养基上的生长速度极显著低于在含有葡萄糖的培养基（图2-b）。
2.1.3 不同氮源对病原菌菌丝生长的影响 由图2可知，Fa-25可在供试的5种氮源进行培养，可利用多种氮源促进生长（图2-a），在含有KNO3、甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸这4种氮源的培养基上生长速度无显著性差异，在含有尿素的培养基上生长速度显著低于上述氮源培养基（图2-c）。
2.1.4 不同光照对病原菌菌丝生长的影响 由图3可知，Fa-25适宜在全光照的条件下培养，生长速度最快，极显著高于在全黑暗和12 h 光照/12 h 黑暗的条件下培养（图3）。
2.1.5 不同pH值对病原菌菌丝生长的影响 由图4可知，Fa-25在pH为6的环境下培养生长速度最快，生长速度为10.81 mm·d-1，在pH为10的条件下极显著降低，降低到2.00 mm·d-1，菌落生长缓慢，边缘不规则（图4）。
2.2 抗病品种的筛选
采用刺伤接种的方法，对15种厚皮甜瓜品种和材料进行致病力的测定，结果表明Fa-25在柏格、HXC12和P80这3个材料和品种上致病力较弱，接种7 d后，病斑直径均小于1.30 cm（图5）；
对10个薄皮甜瓜材料进行接种，致病力均比较强，无抗病品种（图6）；
Fa-25对7个西瓜品种和材料进行接种，均可发病，对东城佳美和兰芯的致病力较弱（图7）；
对5种黄瓜品种和材料进行接种，均可发病，在土×HS、JY4×土这2个材料上发病较弱（图8）。
3 讨论与结论
前人研究发现，镰刀菌属真菌寄主范围广泛，可引起包括南瓜[10]、香蕉[11]、荔枝[12]、西瓜[13]、黄瓜[14]、火龙果[15]、杧果[16]、柑橘[17]等作物的果腐病发生。在我国北至黑龙江省，西至甘肃省，东至浙江省均有由不同镰刀菌引起的甜瓜果腐病发生[4-6，18]。该病害多危害半成熟和成熟的果实，发病初期果实呈水渍状病斑，后期内部开始腐烂，病部长出白色或粉红色霉层。初期不易被发现，由于防治不及时和没有引起足够的重视，在病害发生后，已经无法控制，所以预防非常重要。而选育抗病品种是控制甜瓜果腐病这一病害最有效的途径之一。加强田间管理，选择适宜的栽培管理模式对病害的防控有积极的指导意义。
笔者针对浙江省新发现的由亚洲镰刀菌引起的甜瓜果腐病，开展对引起甜瓜果腐病的亚洲镰刀菌Fa-25进行生物学特性和致病性的研究，结果表明Fa-25喜光，最适宜的温度为28 ℃，不耐高温，在35 ℃時无法生长，不同于朱迎迎等[15]研究发现引起火龙果果腐病的单隔镰刀菌（F. dimerum）的致死温度为75 ℃，Fa-25最适宜的pH为6；
最适宜的碳源和氮源有多种。综合分析表明Fa-25不耐高温，在光照充足、弱酸和富含有机营养的环境有利于该菌的生长和繁殖。
由亚洲镰刀菌引起甜瓜的果腐病是首次在世界上报道[5]，目前国内外并没有亚洲镰刀菌引起瓜类果腐病的报道，但有其他镰刀菌引起的瓜类果腐病报道。杜莉芳等[18]报道的哈密瓜果腐病是由变红镰刀菌ZJHM-01侵染引起的，该病原菌宿主具广谱性，光照能促进生长，最适生长温度为30 ℃，最适pH为7～9，最适碳源为淀粉、山梨醇和葡萄糖，最适氮源为蛋白胨和牛肉膏，但没有测定致病力，与本研究的Fa-25的生物学特性有所差异。此外，除了镰刀菌可引起甜瓜果腐病之外，刘志恒等[19]报道茄丝核菌（Rhizoctonia solani）在辽宁省可引起甜瓜果腐病，主要危害成熟果实，发病部位初期呈褐色，逐渐扩展呈深褐色，从侵染中心开始逐渐外扩，生出白色霉层，外围呈水渍状湿腐，湿度大时白色霉层覆满整个病部，后期果实腐烂。无论是镰刀菌还是茄丝核菌引起的瓜类果腐病，均为真菌性病害，发病果实从外到内开始腐烂，不同于西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli）引起的细菌性果斑病，发病果实从内到外开始腐烂。
未来农业发展的趋势是传统农业向现代化农业转变，选育抗病品种是我国农业未来的发展的核心，减少甜瓜果腐病的发生，促进农业增产增收，对甜瓜产业的可持续发展起到技术支撑作用。利用Fa-25对果实进行刺伤接种，筛选到柏格、HXC12和P80这3个较抗甜瓜果腐病的厚皮甜瓜材料，而在薄皮甜瓜材料上进行接种，致病力均比较强，无抗病品种。亚洲镰刀菌Fa-25也可对西瓜和黄瓜致病，表明亚洲镰刀菌Fa-25的寄主范围较为广泛。尽管目前尚没有亚洲镰刀菌引起西瓜和黄瓜果腐病的报道，但由于镰刀菌普遍存在于土壤中，在土壤中进行传播，因此筛选抗亚洲镰刀菌的甜瓜、西瓜和黄瓜品种仍然非常必要，同时改善土壤连作障碍及进行土壤消毒也可减少土壤中镰刀菌和其他病原菌的数量，减少果腐病及其他病害的发生。
综上，笔者通过对浙江宁海腐烂的甜瓜果实上分离的亚洲镰刀菌（F. asiaticum）Fa-25进行生物学特性和致病力的分析，明确该亚洲镰刀菌Fa-25的最适生长条件，Fa-25喜光，最适生长温度为28 ℃，比较适合的碳源为葡萄糖、乳糖和棉子糖，比较适合的氮源为KNO3、甘氨酸、亮氨酸和丙氨酸，尿素则不利于生长。该病原菌菌丝致死温度为35 ℃，最适的pH为6。利用亚洲镰刀菌Fa-25对葫芦科作物进行抗病筛选，筛选到柏格、HXC12和P80这3个较抗的厚皮甜瓜材料，此外，Fa-25还可对西瓜和黄瓜产生致病力，Fa-25对东城佳美和兰芯这2个西瓜品种的致病力较弱，对土×HS、JY4×土这2个黄瓜材料的致病力较弱。
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