徐平,阚兴池,黄雅萍,刘忆瑶,李宇航,付守鹏,柳巨雄
(吉林大学 动物医学学院,吉林 长春 130062)
奶牛乳腺纤维化是一种以乳腺肌成纤维细胞聚集和细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积为特征的疾病,通常由久治不愈的乳腺炎迁延所致。该病理过程导致产奶量及乳品质下降,严重时可发展为乳腺硬化增加奶牛淘汰率,给奶牛业造成了严重的经济损失。
纤维化是一种慢性损伤后修复过程,受损伤的组织或器官过度地形成纤维结缔组织,其替代了正常组织结构,侵占了功能性细胞的生存空间。虽然目前奶牛乳腺纤维化的具体发病机制还尚未研究清楚,但有研究报道,上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和成纤维细胞激活是纤维化的两个重要病理过程,这种两种过程均产生大量的ECM[1-2]。其中EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的过程。在EMT过程中上皮细胞极性丢失并具备了成纤维细胞的特性,如细胞的迁移能力和分泌ECM的能力显著增强并且伴有大量的趋化因子分泌,导致ECM沉积[1],进而加剧纤维化进程。
此外,有研究表明纤维化的发生发展和炎症密切相关。炎症往往是纤维化的启动因素和驱动力,在纤维化病变过程中往往伴有持续的炎症环境,而炎症环境进一步激活成纤维细胞活化和EMT过程,加剧ECM的进一步积累最终导致纤维化的发生[3]。因此缓解炎症反应和有效阻止上皮细胞EMT进程是有效缓解纤维化病变的潜在治疗途径。但是目前关于奶牛乳腺纤维化的研究相对较少,仍需进一步深入研究。
近年来中药单体用于预防或阻止纤维化进程是一个具有广阔应用前景的研究方向,为纤维化的防治提供了新的思路。甜菜碱(betaine,BT)可从天然植物的根、茎、叶及果实中提取,甜菜的糖蜜是BT的主要来源,其具有良好的抗炎、杀菌、抗肿瘤等药理作用[4-5]。但到目前为止国内外关于BT用于乳腺纤维化治疗的研究尚未见报道。因此本研究探究了BT对由TGF-β1诱导的mMECs纤维化细胞模型的影响及其机制,以期为奶牛乳腺纤维化的防治提供试验数据和理论指导。
1.1 材料BT购买自南京道斯夫技术有限公司,HPLC≥98%;TGF-β1购买于Proteintech公司;TRIzol试剂购买于Invitrogen公司;DMEM粉末培养基购买于Hyclone公司;BCA蛋白测定试剂盒购买于碧云天试剂公司;CCK8试剂购买于北京索莱宝公司; NF-κBp65、P38、ERK、phospho-NF-κBp65、phospho-P38、phospho-ERK、Smad和β-actin抗体购买于Cell Signaling Technology公司;TGF-β1抗体购买于Proteintech公司;COL 1和p-Smad抗体购买于Abcam公司。
1.2 CCK8试验在96孔板中均匀接种细胞,当细胞生长至底壁面积的70%时,用BT和TGF-β1处理细胞48 h。48 h后每孔加入10 μL的CCK8,在37℃细胞培养箱中继续放置1 h,然后将96孔板放置在酶标仪内,检测细胞450 nm处的吸光度,并进行数据分析。
1.3 荧光定量试验将TRIzol试剂加入培养皿中,在室温下裂解细胞。
提取总RNA并进行逆转录反应。
在8连排管中,分别加入8 μL的cDNA、10 μL 的2×SYBR Premix和各1 μL的上下游引物,摇匀后进行PCR。
β-actin作为对照,通过2-ΔΔCt方法确定目标mRNA的相对表达量,检测BT对mMECs细胞产生炎性细胞因子的影响。引物信息见表1。
表1 引物序列
1.4 Western blot试验利用细胞裂解液从细胞中收集蛋白质,使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度,将蛋白转移到4% SDS-PAGE凝胶中电泳75 min。通过半干法将蛋白转移到PVDF膜。用5%脱脂牛奶溶液密封膜2 h。加入一抗(1∶1 000),4℃孵育过夜,洗涤5次,加入山羊抗兔(1∶8 000)或山羊抗小鼠(1∶8 000)二抗,室温孵育1 h,洗涤5次,采用化学发光试剂盒检测蛋白条带。
1.5 数据统计使用软件GraphPad Prism 8对数据进行分析,数据以平均值±标准差表示,组间差异采用单因素方差分析(one way-ANOVA)进行统计学分析。P<0.05具有统计学意义。
2.1 BT或TGF-β1对mMECs存活率的影响如图1所示,1 mol/L以内的BT对mMECs的存活率没有影响,5 mol/L BT对细胞表现出细胞毒性作用。5 μg/L TGF-β1对mMECs的存活率没有影响,因此试验采用1 mol/L BT开展以下研究。
*表示与空白对照组相比P<0.05,**表示与空白对照组相比P< 0.01;#表示与TGF-β1模型组相比P<0.05,##表示与TGF-β1模型组相比P<0.01。下同
2.2 BT对TGF-β1诱导的mMECs中炎性细胞因子的影响炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的过度表达和分泌可以加剧炎症反应的严重程度进而导致纤维化,因此对炎性细胞因子的mRNA水平进行检测。试验结果表明,TGF-β1组炎性因子IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平显著升高,而BT预处理显著降低IL-6、IL-1β、TNF-α的mRNA水平(图2)。结果表明BT能够减少TGF-β1诱导的mMECs的EMT过程中炎性细胞因子的表达。
A.mMECs中IL-1β基因表达情况;B.mMECs中IL-6基因表达情况;C.mMECs中TNF-α基因表达情况
2.3 BT对TGF-β1诱导的mMEC中COL 1、α-SMA蛋白表达水平的影响COL 1、α-SMA蛋白是重要的纤维化表型指标,因此对COL 1、α-SMA蛋白进行了检测。结果显示,与正常组相比,TGF-β1组中COL 1、α-SMA蛋白表达水平显著升高,但BT干预后COL 1、α-SMA蛋白表达水平显著降低(图3)。这一研究结果表明BT通过抑制COL 1、α-SMA蛋白水平的升高,有效缓解mMECs的EMT进程,减少ECM的积累。
A.mMECs中COL 1,α-SMA的蛋白水平;B.mMECs中COL 1蛋白的相对密度值分析;C.mMECs中α-SMA蛋白的相对密度值分析
2.4 BT对TGF-β1诱导的mMECs中NF-κB信号通路的影响有研究表明,NF-κB信号通路在细胞炎症过程中具有重要作用。为了研究BT抑制炎症反应的机制,利用Western blot技术检测NF-κB信号通路,结果表明TGF-β1处理导致NF-κBp65,IκBα的磷酸化水平显著升高,而BT能够显著降低NF-κBp65,IκBα磷酸化水平的升高(图4A,B,C),此外,利用分子对接技术对BT和p65的相互作用进行模拟,发现BT和p65蛋白的结合能为-14.6 kJ/mol,并且BT和p65蛋白的氨基酸残基ASN-155具有氢键相互作用,推测其可能是BT和p65相互作用的活性位点(图4D)。上述结果表明BT和p65具有很强的结合作用,进一步验证了BT在NF-κB活化中的作用。
A.mMECs中p-NF-κB p65,p-IκBα蛋白水平;B.mMECs中p-NF-κB p65蛋白的相对密度值分析;C.mMECs中p-IκBα蛋白的相对密度值分析;D.采用AutoDock 4模拟p65与BT的分子对接
2.5 BT对mMECs中TGF/Smad信号通路的影响TGF/Smad通路在纤维化的发生发展中发挥重要的作用。因此,利用Western blot技术检测TGF/Smad通路,发现BT能够显著降低TGF-β1诱导的TGF/Smad信号通路的激活(图5A,B,C)。
此外,利用分子对接技术对BT和Smad蛋白的结合进行预测,发现BT和Smad蛋白的结合能为-17.5 kJ/mol,并且BT和Smad蛋白的氨基酸残基ARG-219和ASP-309具有氢键相互作用,推测其可能是BT和Smad相互作用的活性位点(图5 D)。上述结果证实BT和Smad具有很强的结合作用,进一步验证了BT在TGF/Smad信号通路的作用。
A.mMECs细胞中p-Smad,TGF蛋白相对表达水平; B.mMECs细胞中p-Smad蛋白的相对密度值分析;C.mMECs细胞中TGF蛋白的相对密度值分析;D.采用AutoDock 4模拟p65与Smad的相互作用
奶牛乳腺纤维化通常由久治不愈的乳腺炎迁延所致,该病理过程使产奶量及乳品质下降,严重时可发展为乳腺硬化增加奶牛淘汰率,给奶牛业造成严重的经济损失。目前尚缺乏效果明显的预防和缓解药物,因此寻找预防奶牛乳腺纤维化的新治疗药物显得十分必要。在本研究中,以TGF-β1刺激mMECs为细胞纤维化模型,发现BT能够通过抑制NF-κB和TGF/Smad信号通路缓解纤维化。
炎症常常伴随着纤维化的发生发展,当炎症发生时,会产生大量的炎性细胞因子,例如IL-1β、TNF-α和IL-6等, 并引发联级反应[6], 成纤维细胞和上皮细胞启动异常修复模式,导致ECM沉积并最终形成不可逆纤维化[7]。有研究表明持续的炎症刺激是纤维化非常重要的原因和纤维化的前置状态,因此,抑制IL-1β、TNF-α和IL-6的分泌是减少ECM积累的有效途径[8]。本研究在TGF-β1诱导的mMECs纤维化模型中发现,BT显著抑制炎性细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,因此,BT可以有效消除或减轻TGF-β1对mMECs的持续炎症刺激,继而对后续纤维化产生抑制作用。
尽管乳腺纤维化的发病机制尚不完全清楚,但ECM过度沉积对促进纤维化发生已有大量研究报道。collagen蛋白是ECM的主要代表成分,HAMEED等[9]研究表明抑制collagen 1蛋白水平的升高可以有效地缓解肝脏纤维化的发展。此外,EMT过程在纤维化的发生发展中也起着关键作用,EMT期间上皮细胞具备成纤维细胞特点,其迁移能力和分泌能力显著增强,上皮细胞黏蛋白减少,α-SMA表达增加,促使ECM大量产生[4]。LU等[10]研究发现通过抑制α-SMA的表达可缓解肾脏纤维化的发展。本研究采用Western blot技术检测纤维化相关COL 1和α-SMA蛋白的表达。结果表明,与TGF-β1组比较,经过BT干预后mMECs中COL 1、α-SMA蛋白的表达水平显著降低,以上结果表明BT对TGF-β1诱导的细胞纤维化模型具有抑制作用,有效缓解mMECs的EMT进程,减少ECM的积累。
为了探究BT抑制TGF-β1诱导的mMECs炎症反应的潜在机制,本研究检测了NF-κB信号的激活情况。有报道指出天然产物往往具有抑制纤维化过程中NF-κB信号激活的作用, 如竹节参皂苷通过抑制NF-κB介导的炎症反应的发生有效地缓解肾纤维化[11]。因此,BT可能会通过类似的方式来发挥对纤维化的治疗作用。在许多炎症反应中,NF-κB信号通路通过促进炎症因子的转录调控炎症反应,被认为是减轻炎症的潜在靶点。正常情况下,NF-κBp65存在于细胞质中与IκBα结合紧密,但在受到外界刺激后,IκBα被激活降解和磷酸化,导致NF-κBp65磷酸化,随后NF-κBp65经历核转位并发挥转录作用[12]。本研究发现TGF-β1诱导mMECs中NF-κBp65和 IκBα的磷酸化,而BT能够显著抑制NF-κBp65和IκBα的磷酸化。以上试验结果表明,在TGF诱导的mMECs纤维化的过程中,BT通过抑制NF-κBp65信号通路来抑制炎症反应的发生。
TGF-β1是一种多功能细胞因子,在细胞的增殖分化、创伤 修复、免疫反应和炎症反应等过程中具有重要的调节作用[13]。越来越多的证据表明,TGF-β1/Smad信号通路的异常激活是导致纤维化的主要原因[14-16]。在肝脏纤维化的研究中显示,TGF-β1与肝损伤、肝细胞凋亡密切相关, 也是诱导肝纤维化发生的重要原因之一[14]。LANG等[17]发现 TGF-β1 siRNA可显著下调TGF-β1的表达,抑制肝星状细胞的增殖,减少CoL-I和CoL-Ⅲ的产生,从而改善大鼠肝纤维化的发展。因此,抑制TGF-β1的表达和分泌是缓解纤维化病理过程的有效途径[18]。Smad蛋白是目前已知的TGF-β1受体细胞内激酶最重要的底物[19]。TGF/Smad是促进纤维化发生发展的重要信号通路,SHEN等[20]发现,在心肌纤维化过程中TGF/Smad信号被异常激活,而抑制TGF/Smad信号通路的激活能够缓解纤维化的发生,目前开发TGF/Smad信号的有效抑制剂是缓解纤维化疾病的重要研究方向。本研究发现BT显著抑制TGF/Smad信号通路的激活。本研究的结果表明,BT通过抑制TGF/Smad信号通路,从而抑制TGF-β1诱导的mMECs纤维化的发生。
综上所述,本研究得出以下结论,BT对TGF-β1诱导的mMECs纤维化细胞模型具有缓解作用,其作用机制是BT一方面抑制NF-κB信号的激活,抑制炎症反应,间接缓解EMT进程;另一方面直接抑制TGF/Smad信号通路的激活减轻纤维化表型指标的升高,进而减少ECM沉积。因此,BT有望成为防治奶牛乳腺纤维化的潜在药物。
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