李兴美 杨盼盼 何 勇* 陈 茜 钟孟淮
（1．贵州农业职业学院，贵州 贵阳 551400；
2．贵州师范学院，贵州 贵阳 550018）
酶在生物新陈代谢中参与催化物质转化过程，不同环境对酶活性具有不同影响。如低温对淀粉酶和过氧化物酶活性影响不大，高温可使淀粉酶和过氧化物酶活性增强[1]。米槁种子通过不同温度层积处理，其过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（CAT）活性整体表现出先升后降的动态变化[2]，耐高温胞外酶可促进天麻种子酶活性升高，从而促进天麻种子萌发[3]。人工模拟干旱胁迫植物，在1～14 d，3种绿化植物酶活性呈上升趋势，在14～20 d，3 种绿化植物酶活性呈下降趋势[4]。不同植物中SOD、CAT、乙醇脱氢酶（ADH）活性呈规律性分布[5]。研究表明，重金属不但影响土壤中酶活性，对植物酶活性也有较大影响，如低浓度铬和铜可促进花生种子萌发，高浓度铬和铜可抑制花生种子萌发[6]。土壤被镉污染后，水稻土壤脲酶、过氧化氢酶以及土壤过氧化物酶活性均受到抑制，当采用超顺磁性微纳米Fe3O4-磷酸盐功能化材料（MFH）修复后，3 种酶活性均提高，水稻机体中酶活性也受到影响[7]，表明酶活性直接影响农作物生产效益。本研究主要研究紫花苜蓿、黑麦草、苦荞、甜荞等种子萌发过程中酶活力，探索种子萌发酶活性的最佳控制条件，从而提高牧草的生产力，为贵州省畜牧产业发展、生态农业的发展提供参考。
1.1 供试地点
试验在贵州农业职业学院实验室进行。
1.2 供试材料
紫花苜蓿和黑麦草的种子由贵州省毕节市畜牧局提供，甜荞和苦荞种子由贵州省紫云县畜牧服务中心提供。
1.3 试验仪器
恒温水浴锅（常州市亿能实验仪器厂）、TG1650-WS 台式高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）、恒温培养箱（青岛精诚仪器仪表有限公司）、紫外分光光度计（上海奥析科学仪器有限公司）、电子天平（上海元析仪器有限公司）。
1.4 试验试剂
3,5-二硝基水杨酸（上海展云化工有限公司），麦芽糖、柠檬酸钠、柠檬酸、可溶性淀粉（天津市致远化学试剂有限公司），氢氧化钠（川东化工集团），酒石酸钾钠（成都金山化学试剂有限公司）。
1.5 试验方法
1.5.1 种子预处理
种子预处理采用5 种方式，即常温浸泡10 h，冷却2 h （对照组）；
初始水温27 ℃浸种10 h，冷却2 h（T1组）；
初始水温30 ℃浸种10 h，冷却2 h（T2组）；
初始水温33 ℃浸种10 h，冷却2 h（T3组）；
初始水温36 ℃浸种10 h，冷却2 h（T4组）[8]。采用恒温箱进行种子萌发试验，定时补加蒸馏水，保持滤纸湿润[9]，每种处理重复3次。
1.5.2 种子萌芽
培养皿内铺两层90 mm 滤纸，将不同温度预处理的牧草种子取30粒均匀摆放，置于25 ℃的光照培养箱中进行发芽，每天光照12 h，相对湿度为（75±1）%。从第2 d开始计算种子发芽率。
1.5.3 麦芽糖标准曲线的制作
1.5.3.1 标准曲线的制作原理
种子萌发时淀粉酶水解后活性增强，将淀粉分解成小分子糖类。其中α-淀粉酶水解淀粉α-1,4-糖苷键，将淀粉分解为麦芽糖、麦芽三糖和糊精等还原性糖，β-淀粉酶水解非还原端第二个α-1,4-糖苷键，产物为麦芽糖和一部分糊精糖化，为种子幼苗生长提供能量来源。在测定酶的过程中将其中之一钝化，测定α-淀粉酶活力，在非钝化条件下测定总淀粉酶活力。
1.5.3.2 标准曲线的制作
取7 支带有塞和刻度的试管（均消毒）进行编号，加入试剂，摇匀，放入沸水浴中煮沸5 min，取出，流水冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以1 号管作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定吸光度。以麦芽糖含量为X轴，吸光度为Y轴，绘制标准曲线，见图1。
图1 标准曲线
1.6 淀粉酶活力测定
在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg)，计算酶活力[10]。
1.7 数据统计与分析
试验数据采用SPSS 25.0软件进行分析，一般线性单变量双因素统计数据，LSD 法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”，P＜0.05表示差异显著。
2.1 黑麦草种子萌发酶活力（见表1）
表1 黑麦草种子萌发酶活力 单位：U
由表1 可知，黑麦草种子酶淀粉酶总活力、α-淀粉酶活力和β-淀粉酶活力，萌发第1 d与第3、4 d之间酶活力变化显著（P＜0.05），第2 d 与第3、4 d 之间变化显著（P＜0.05）；
第1、2 d 之间变化不显著（P＞0.05），第3、4 d之间变化不显著（P＞0.05）。不同温度对黑麦草种子酶总活力、α-淀粉酶活力、β-淀粉酶活力影响不显著（P＞0.05）。
2.2 紫花苜蓿种子萌发酶活力（见表2）
表2 紫花苜蓿种子萌发酶活力 单位：U
由表2可知，不同萌发天数、不同温度处理，黑麦草种子淀粉酶总活力差异均不显著（P＞0.05）。不同萌发天数黑麦草种子的α-淀粉酶活力变化不显著（P＞0.05）；
不同萌发天数在30、33、36 ℃的α-淀粉酶活力均显著高于27 ℃（P＜0.05）。不同萌发天数黑麦草种子的β-淀粉酶活力变化不显著（P＞0.05）；
不同萌发天数黑麦草种子在30 ℃的β-淀粉酶活力均显著高于27、33、36 ℃（P＜0.05）。
2.3 苦荞麦种子萌发酶活力（见表3）
表3 苦荞麦种子萌发酶活力 单位：U
由表3 可知，不同萌发天数间苦荞麦种子的淀粉酶总活力变化不显著（P＞0.05）；
萌发天数第1、3 d，苦荞麦种子36 ℃淀粉酶总活力显著低于27、30、33 ℃（P＜0.05）。不同萌发天数的苦荞麦种子α-淀粉酶活力变化不显著（P＞0.05）。不同温度处理，27 ℃与36 ℃、30 ℃与33 ℃之间苦荞麦种子α-淀粉酶活力的变化不显著（P＞0.05），萌发第1、2、3 d，36 ℃苦荞麦种子α-淀粉酶活力显著低于30、33 ℃（P＜0.05）。不同萌发天数的苦荞麦种子β-淀粉酶活力变化不显著（P＞0.05），萌发第2、3 d，33 ℃苦荞麦种子β-淀粉酶活力显著低于27、30 ℃（P＜0.05）。
2.4 甜荞麦种子萌发酶活力（见表4）
表4 甜荞麦种子萌发酶活力 单位：U
由表4 可知，不同萌发天数和温度甜荞麦种子淀粉酶、α-淀粉酶和β-淀粉酶活力差异均不显著（P＞0.05）。
牧草生产与种子萌发活力存在很大关系，豆科牧草种子酶活性较强，相同保存年限条件下，豆科牧草活力比禾本科种子强[11]，可提高可溶性糖、蛋白质和脂肪含量[12]。随着种子贮藏年限增加，种子中SOD 活性呈先升后降趋势，POD 活性呈上升趋势，CAT 活性呈下降趋势[13]，变劣种子可引起一系列酶活性变化，导致膜脂遭受破坏[14]，直接影响牧草产值。盐对种子萌发幼苗中SOD、POD、CAT 活性具有一定影响[15]，为抗盐胁迫。苔草中POD、CAT、PDC 活性出现规律性变化[5]，牧草种子中SOD、POD、CAT 是保护系统，可防止脂质过氧化，种子健壮度、发芽率、出苗率、幼苗生长、植株抗逆能力、生产潜力与SOD、POD、CAT 密切相关[12]，防御酶基因表达促进植物下表皮厚度、叶片组织疏松度和植株中氨基酸含量[16]，酶制剂可促进水稻和小麦秸秆营养物质的消化和利用[17]。不同产区不同科属种子，酶活性也存在一定差异性，如河南产区紫苏种子发芽酶活高于其他产区[18]。pH值也可对发芽期作物种子CAT和POD活力影响。豆科作物种子中储存脂肪、蛋白质和淀粉，种子萌发时脂肪酶、转氨酶和淀粉酶起重要作用[19]。转氨酶活力升高，蛋白质代谢加快，合成蛋白质增多，抗重金属能力增强。酶活性促进了紫花苜蓿叶片中α-淀粉酶、β-淀粉酶基因表达，紫花苜蓿中淀粉积累增强抗寒耐冻能力，因此，α-淀粉酶和β-淀粉酶在优质牧草中抗逆性方面起重要作用[20]。接种AM 真菌可提高土壤多酚氧化酶及过氧化氢酶的活性，提高狗尾草、荩草及鬼针草碱性蛋白酶和碱性磷酸酶活性，促进牧草生物量积累[21]。
不同浸种方式也可改变种子活力，不同浓度高锰酸钾和清水浸泡的华重楼种子种子酶活力存在一定差异[22]，2,6-二叔丁基苯酚和外源激素具有提高作物种子萌发抗氧化酶活性能力[23-24]。种子萌发时水解酶被激活，淀粉被分解产生葡萄糖，为种子萌发提供能量，不同发芽天数酶活力存在一定差异[25]。不同浸种温度可促进种子淀粉酶活性，增强种子生活力，提高种子发芽率。以50%种子正常发芽为最低、最高温度界限，最高发芽率为最适温度[26]，种子萌发最适、最高和最低三基点温度控制种子酶活性大小，适宜温度为种子萌发酶活性关键，对提高种子发芽率具有促进作用[27]。酶活性对环境温度较敏感，因此不同环境种子萌发酶活性存在差异[28-29]。
本试验主要研究常见牧草即黑麦草、紫花苜蓿、苦荞麦、甜荞麦牧草种子萌发酶活力，通过不同温度水浸种处理后进行种子萌发，测定4 种牧草种子不同萌发天数α-淀粉酶、β-淀粉酶和酶总活力的变化规律，探索贵州牧草发展的思路，为牧草产业发展提供一定参考。近年来，贵州省大力实施种草养畜项目，引进的外来牧草在生长过程中往往出现杂草多、抗逆性弱、易退化、利用年限短等现象[30]。因此，改变浸种水温提高牧草的出芽率和质量，提高牧草种子萌发酶活力对改良天然草地和建植人工草地等具有重要意义[31]。
本研究表明，随着苦荞麦、甜荞麦种子萌发天数增加，其淀粉酶活性呈先升高后下降的趋势。黑麦草、紫花苜蓿和苦荞麦种子分别在36、33、30 ℃温度处理后，种子酶活力较高；
不同温度处理对甜荞麦种子萌发影响不明显。