孙小龙，徐怀德，米林锋，毛敏，樊慧华，侯磊磊
1. 榆林市食品检验检测中心（榆林 719000）；
2. 西北农林科技大学食品科学与工程学院（杨凌 712100）
近年来，研究得知亚硝胺类化合物（nitrosamines，NAms）是一种很强的化学致癌物质，广泛存在于肉质类食物、化妆品、啤酒、香烟等食品中，而通常在腌制肉的制作工艺中N-二甲基亚硝胺是由蛋白质分解产物二甲胺在与亚硝酸盐经过系列反应生成[1-2]，是一种强致癌物质，一般表现急性中毒症状，长期食用会导致肝硬化，肾脏衰竭。腌制肉和酱卤肉多含有N-亚硝胺[3-5]，其中又以N-二甲基亚硝胺检出率最高[6]。GB 2762——2017《食品中污染物限量》中规定水产品中N-二甲基亚硝胺的限量值为4 μg/kg[7]，另一方面由于腌制肉制品中含量较低，且样品基质复杂，准确检测亚硝胺类化合物难度较大，因此建立快速、高效检测N-二甲基亚硝胺检测方法，对监控食品安全和保障消费者健康有极其重要意义[8]。
榆林羊杂碎是陕北传统小吃的典型代表，有着浑厚的饮食文化底蕴，更有广泛的美食影响力，制作工艺上以羊肉汤料为主，添加薯条、豆条、粉条、香菜、调味料等多种食材，讲究食材多样，即食色香味滋形俱全，具有典型的地域饮食特征，包含了地方饮食的特色标签。国内对亚硝胺类物质检测主要有气相色谱法[10-11]、气相色谱-质谱法[12-13]、气相色谱-串联质谱法[14-15]及液相色谱-串联质谱法[16-22]等，而对于羊杂碎中N-二甲基亚硝胺检测则鲜有文献报道，针对榆林市特色食品羊杂碎中N-二甲基亚硝胺污染物通过采用QuEChERS-气相色谱-质谱联用法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS），对比水蒸气蒸馏-GC-MS联用法建立测定羊杂碎中N-二甲基亚硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）的快速高效检测方法，该方法简单、快速，净化效果好，灵敏度更高，以期为当地特色食品羊杂碎中N-亚硝胺类化合物的分析测试研究提供试验依据，积极探索满足羊杂碎中NDMA的高效检测需求。
1.1 材料与试剂
羊杂碎样品（生产企业送检样品）；
氯化钠（中国医药集团有限公司）；
无水硫酸镁（MgSO4-5H2O，密欧化学试剂有限公司）；
乙酸、乙腈、二氯甲烷和正己烷（中国医药集团有限公司）；
NDMA标准品（纯度99.8%，TGI公司）；
PSA、C18（Agela Technologies）；
DPC复合净化柱、GCB（北京DIKMA公司）。
1.2 仪器与设备
串联质谱仪（7890B-7000C，安捷伦）；
分析天平（ME204，梅特勒）；
多功能振荡器（HY-4）；
均质器（HBM-400B）；
全自动平行浓缩仪（MV-5）；
智能水蒸气蒸馏仪（ST106-1RW+STER02）；
涡旋振荡器（MS-3型）；
样品粉碎机（FW-200）；
实验室用水（经Milli-Q净化超纯水）。
1.3 试验方法
1.3.1 标准溶液配制
NDMA标准品用二氯甲烷配制成5.0 μg/mL的标准储备液，于-18 ℃冰箱避光保存，用不含NDMA羊杂碎处理后的基质溶液将储备液别稀释至20，50，100，200，500和1 000 ng/mL标准工作液，避光保存。1%乙酸-乙腈提取溶液：取500 mL乙腈，加入冰乙酸5 mL，摇匀。
1.3.2 仪器分析参数
1.3.2.1 色谱条件
色谱柱DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；
载气为氮气；
进样口温度220 ℃；
升温程序：初始温度40 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃保持1 min；
色谱柱流量1.2 mL/min；
进样量1 μL；
检测器温度280 ℃；
不分流进样。
1.3.2.2 质谱条件
离子源温度230 ℃，辅助加热器230 ℃。监测测模式：选择离子模式监测（SIM），定性定量监测离子42/43/44/74。
1.3.3 试样方法
1.3.3.1 QuEChERS前处理
随机选择企业送检包装羊杂碎样品，切碎混匀，用均质器成匀浆，称取20 g样品加入10.0 mL乙腈（含有1%冰乙酸），涡旋振荡2 min加入无水MgSO4和氯化钠，涡旋振荡2 min，按6 000 r/min离心5 min后，吸取5 mL上层清液，加入复合净化小柱DPC（100 mg C18+100 mg PSA+100 mg MgSO4）净化，收集净化液，在5 000 r/min转速下再离心5 min后，氮吹至近干，乙腈定容至1.0 mL，过0.22 μm微孔滤膜后，上机测样。
1.3.3.2 水蒸气蒸馏法前处理
参考GB 5009.26——2016《食品安全国家标准 食品中N-亚硝胺类化合物的测定》羊杂碎样品粉碎均匀后称取200 g于1 L蒸馏瓶中，分别加入100 mL水和50 g氯化钠于样品瓶中，加入10粒玻璃球，连接全自动水蒸气蒸馏仪蒸馏，放入冰水浴中，收集液管没入二氯甲烷液面以下。开启蒸馏装置，收集冷凝液，冷凝液液面上升至400 mL位置后，关闭加热装置，停止蒸馏。蒸馏馏出液加入20 g氯化钠和3 mL硫酸，搅拌至完全溶解，移至500 mL分液漏斗，转移下层液，二氯甲烷多次提取，合并下层液。用10 g无水硫酸钠将将萃取液脱水后，旋转蒸发，采取40 ℃水浴浓缩方式浓缩至5 mL，定容至2.0 mL，上机分析。
2.1 色谱柱选择
对比不同极性色谱柱如非极性柱HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、中等极性柱DB-35（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、强极性柱DB-WAXETR（30 m×0.25 mm，0.25 μm）对NDMA分离的影响。结果表明：选用非极性柱HP-5MS时，NDMA色谱峰受溶剂峰影响大，且有色谱峰展宽的现象，存在明显拖尾现象；
中等极性柱DB-35测定时，峰展宽现象明显；
选用强极性柱DB-WAXETR时，色谱峰尖锐，分离度好。因为亚硝胺分子结构具有强极性和强挥发性，强极性柱DB-WAXETR测定NDMA实现较好的很分离效果。因此选用DB-WAXETR作为色谱柱。
2.2 萃取率比较
分析3种样品前处理过程对NDMA萃取效率的影响，试验采用加标回收率对不同前处理萃取效率进行评价，分别以加标水平0.5，1.0，2.0和4.0 μg/kg计算2种前处理方式的萃取率水平，按式（1）计算。
式中：CS为NDMA实际检测含量，μg/kg；
CA为空白样品中NDMA含量，μg/kg；
Ca为NDMA添加量，μg/kg。
结果表明（图1），羊杂碎中不同加标含量NDMA在2种前处理过程回收率差别明显，QuEChERS前处理NDMA回收率在67.5%～87.5%之间，而采用水蒸气蒸馏法处理样品NDMA回收率在60.2%～80.9%之间，说明羊杂碎样品经水蒸气蒸馏提取过程NDMA损失相对较多，回收率相较QuEChERS前处理较低，因此试验前处理选用QuEChERS方法。
图1 不同前处理过程对NDMA萃取效率的影响
2.3 样品前处理条件优化
GB 5009.26——2016检测方法中水蒸气蒸馏法操作繁琐，称样量较大，耗时长，适用性不强，蒸馏过程操作温度高，萃取过程大量使用二氯甲烷等有机试剂，易使被测物质亚硝胺损失。张伟伟等[21]采用水蒸气蒸馏法提取食品中N-二甲基亚硝胺，经二氯甲烷提取，样品添加回收率在84.5%～101%之间，而QuEChERS前处理方便快捷，又可避免上述水蒸气操作弊端，因此采用QuEChERS对样品进行前处理。
2.3.1 提取溶剂优化
研究表明试验过程中提取溶剂极性不同会对NDMA含量的检测产生较大影响，因此在羊杂碎样品前处理过程选择合适的提取溶剂。将二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯和乙腈（1%乙酸）作为提取溶剂进行提取效率比价，结果表明（图2）：正己烷、二氯甲烷对目标物质的提取率一般，平均回收率为72.1%；
由于正己烷和二氯甲烷为亲油性，但极性相较乙酸乙酯和乙腈偏弱，同时乙酸乙酯为亲油性同时有一定的亲水性，对NDMA提取效果好于上述两种提取溶剂，且回收率均较高，但提取的杂质较多，极易溶解大分子物质如蛋白和油脂类等物质，图谱上杂峰较多，干扰较为明显，由于NDMA含有胺基结构，属于亲核型化合物，所以在萃取体系中加入一定比例乙酸有利于目标物萃取，同时1%乙酸的加入掩蔽了色谱系统的活性，峰形和响应明显提高。因此试验采用（1%乙酸）乙腈作为检测羊杂碎NDMA的提取溶剂，50ng/mL NDMATIC图见图3，50ng/mLNDMA特征离子图见图4，NDMA特征离子丰度图见图5。
图2 不同提取溶剂对NDMA回收率的影响
图3 NDMA TIC图（50 ng/mL）
图4 NDMA特征离子图（50 ng/mL）
图5 NDMA特征离子丰度图
2.3.2 盐析和脱水剂的选择
由于提取溶剂乙腈微溶于水，因此该提取液中体系存在少量水分导致后期分离难等问题，通过对比MgSO4和NaCl不同配比（4∶1，3∶2，2∶3和1∶4，W/W）对NDMA提取效率高低的影响，图6表明，无水MgSO4和NaCl添加量配比4∶1（W/W）时分离效果更好，NDMA回收率达79.3%，明显高于其他MgSO4和NaCl例比，说明该配比NaCl通过盐析分层作用使得水溶性杂质降低，避免提取液中干扰基质对检测结果的影响，同时无水MgSO4可较快除去提取溶剂中的水分及盐析后的水相层，因此本试验盐析过程采用4 g无水MgSO4和1 g NaCl添加量。
图6 不同MgSO4和NaCl配比对NDMA萃取效率的影响2.3.3 吸附和净化剂的选择
羊杂碎以羊杂为主料，汤料中富含脂肪、蛋白等干扰物质，不同的吸附和净化剂会对NDMA含量的检测产生较大影响。而QuEChERS方法常用的吸附剂为C18、PSA、GCB等，其中大多用于植物源性食品，对于含油脂较高样品去除能力一般，试验对比C18、PSA、GCB及复合净化小柱DPC（100 mg C18+100 mg PSA+100 mg MgSO4）除油脂的效果，由于DPC特殊结构对脂质中C5及以上的碳链具有非常强的选择吸附性，既可以除掉基质干扰物的同时也不会吸附目标物而造成检测结果的偏差。对比发现DPC相较PSA和C18等吸附剂去除油脂效果较好。同时，针对羊杂碎中油脂较多的特点，为进一步去除样品中的油脂，试验前采用在-20 ℃冰箱冷冻提前冷冻1 h。试验对4种固相萃取柱C18、PSA、GCB及复合净化小柱DPC的净化效果进行比较。通过样品加标试验，比较每种萃取柱分别对NDMA回收率以确定最佳的固相萃取柱。由表1可知，DPC的净化效果最好，回收率可达85.6%。这是因为羊杂碎中尤其是汤料羊杂中含有大量油脂和脂肪酸，DPC对于脂质中C5及以上的碳链吸附性较强，去除油脂和脂肪酸效果较好，因此试验采用迪马公司的混合吸附剂DPC对样品进行净化。
表1 种固相萃取小柱净化效果比较
2.4 基质效应（matrix effect，ME）影响
检测过程由于样品基质、前处理过程、色谱分离效果等差异影响，检测中产生对待测化合物离子增强或抑制的基质效应，进而严重影响定量结果的准确性。GC-MS/MS为减弱待测目标物基质效应的影响，主要解决方法主要为通过向不含待测物即阴性样品处理液中添加待测物与接近浓度标准溶液响应作为对比，确定较为准确的检测范围，尽量避免检测过程中基质效应对于检测结果准确性影响[23]，由于试验前处理采用QuEChERS方法简单高效，因此试验采用基质匹配标准液做校准曲线消除基质效应干扰，利用相对响应值法，根据入式（2）计算羊杂碎NDMA中的ME。
式中：ME为基质效应；
Ac为某一浓度水平空白基质标准吸光度；
Am为纯溶剂标准吸光度。
考察羊杂碎不同浓度下NDMA基质效应的强弱，按1.3.4.1方法进行前处理并配制质量浓度20，50，
100，200和500 ng/mL的NDMA纯溶剂标准溶液和空白羊杂碎基质匹配标准溶液，通过测定NDMA在上述2种溶液的响应值比较，若二者响应比值ME大于115%则表现较明显的基质增强效应，若ME小于85%则基质抑制效应明显，ME介于85%～115%则无基质效应。图7表明，羊杂碎中NDMA测定过程存在明显的基质效应干扰，浓度越小，羊杂碎基质中NDMA表现为基质增强效应，质量浓度100 ng/mL时，ME为109.3%，且随着浓度的增加，基质效应逐渐减弱，NDMA质量浓度达到200 ng/mL以上时，不表现基质效应。说明羊杂碎中不同浓度NDMA在同基质中具有不同的基质效应表现，同时也表明基质效应与浓度具有一定关系，随着浓度的增加，羊杂碎中NDMA基质效应逐渐减弱。因此采用基质标准曲线校准能减小基质效应对检测结果的影响。
图7 羊杂碎基质中不同浓度NDMA基质效应比较
2.5 方法评价
2.5.1 线性范围及检出限
称取6份空白羊杂碎样品，按照上述方法处理，用20，50，100，200，500和1 000 ng/mL质量浓度的空白羊杂碎样品基质标准溶液为基准，线性方程及相关系数见表2。以信噪比为（rSN=3或10）分别计算检出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），见图8和表2。
表2 羊杂碎中NDMA回归方程、相关系数、线性范围和定量限
图8 羊杂碎中NDMA回归方程、相关系数
2.5.2 回收率及精密度
随机选择羊杂碎样品，在1.0，2.0和5.0 μg/kg 3个水平下进行加标回收试验，回收率范围为78.6%～89.0%，见表3。
表3 羊杂碎中NDMA不同添加水平下回收率和精密度结果
2.6 样品测定
采用所建立的方法对企业送检16个羊杂碎样品进行检测，在所有样品中均检出NDMA残留，含量为0.94～8.36 μg/kg，表明榆林市羊杂碎中在存在NDMA残留，但含量基本小于限量要求。该检测方法可满足羊杂碎中NDMA的高效检测需求。
采用QuEChERS-GC-MS联用法建立测定榆林特色食品羊杂碎中NDMA的快速高效检测方法。该方法简单、快速，净化效果好，灵敏更高度，可满足羊杂碎中NDMA的高效检测需求，也为监管部门对于羊杂碎中亚硝胺类污染物检测提供有力技术支撑，具有一定实际应用价值。
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