黄娜，罗玲，罗惠波, ，黄丹, ，李子健, *
1. 四川轻化工大学生物工程学院（自贡 643000）；
2. 四川化工职业技术学院（泸州 646300）；
3. 酿酒生物技术及应用四川省重点实验室（自贡 643000）
苹果酒作为世界上产量第二大的果酒，具有营养丰富、适量饮用有益健康等特点[1]。更为重要的是，苹果酒保留了苹果中很多的营养物质，相比粮食发酵制成的酒更具营养[2]。国内外研究认为酵母是形成苹果酒香气最重要的因素，酿酒酵母具有酒精转化率高且发酵彻底的特点，但其单独发酵通常会造成苹果酒香气单一、风味同质化问题。因此，将葡萄酒有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）[3-4]、异常维克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）[5]、德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）[6]和马克斯克鲁维酵母菌（Kluyveromyces marxianus）[7]等产香酵母应用于苹果酒酿造中。结果表明，这类产香酵母能将原料中的前体物质转化为酯、酸和高级醇等风味物质，并合成多种酶，对苹果酒色泽、风味的形成具有重要的作用[8]。近年来，将产香酵母与酿酒酵母混合发酵酿造苹果酒为国内外研究的热点：Satora等[9]发现在苹果酒酿造中，与纯培养相比，混合培养（在大多数情况下）能产生更多的乙醇、甲醇和挥发性酯；
Liu等[10]评估酿酒酵母和Williopsis saturnus共发酵对苹果酒挥发性特征的影响，共发酵导致更复杂的挥发性特征，可能会影响苹果酒的芳香特性；
曾朝珍等[11]对德尔布有孢圆酵母（Torulaspora delbrueckii）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）单独和混菌发酵过程中苹果酒香气成分进行测定发现，混菌发酵有利于增加苹果酒香气成分的复杂性。
已报道的关于Candida tropicalis主要是应用于木瓜酒[12]、苹果醋[13]等，而将Candida tropicalis作为产香酵母，与酿酒酵母混合培养应用于苹果酒的酿造还鲜有报道，试验以单接种酿酒酵母为对照组，对酿酒酵母和Candida tropicalis混菌发酵不同添加比例对苹果酒风味物质合成的影响进行探究，以期为Candida tropicalis在苹果酒酿造中的应用提供理论数据。
1.1 材料与试剂
红富士苹果（市售）；
酿酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；
Candida tropicalis（从苹果中分离得到，保存于酿酒生物技术及应用四川省重点实验室）；
果胶酶（30 000 U/g，上海源叶生物科技有限公司）；
柠檬酸（广西珍露食品有限公司）；
焦亚硫酸钾（烟台帝伯仕酵母有限公司）；
乙酸正戊酯（Adamas试剂有限公司）；
氯化钠（成都市科龙化工试剂厂）。
1.2 仪器与设备
DZKW-4水浴锅（北京中兴伟业世纪仪器有限公司）；
ST2100 pH计（奥豪斯仪器有限公司）；
ZHJH-C118C超净工作台、ZWYR-D2403恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；
50/30 μm DVB/CAR/PDMS纤维萃取头（美国Supelco公司）；
7890A/5975B气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司）。
1.3 方法
1.3.1 苹果酒的发酵试验
1.3.1.1 工艺流程及操作要点
工艺流程：苹果→挑选→清洗、去皮、去核、切碎→榨汁→焦亚硫酸钾→果胶酶→调糖、调酸→灭菌→接种→发酵→苹果酒
操作要点：将苹果洗净去皮，去核，并切为小块，放入100 ℃左右的热水中，浸泡5 min左右，果肉与去离子水按1∶1（W/W）比例榨汁，及时添加90mg/L SO2（添加固体焦亚硫酸钾代替），同时添加50 mg/L的果胶酶充分混合均匀后，分别添加精制白砂糖和柠檬酸来调整糖度和pH，于100 ℃灭菌5 min，调整酵母菌浓度为1×106CFU/mL，酿酒酵母按照10%（V/V）的接种量，培养箱中恒温发酵7 d，糖度＜4 g/L时，即可终止发酵，得到苹果酒。
1.3.1.2 发酵比例
按表1的4种接种比例同时接种2种酵母菌。其中，A为单接种酿酒酵母，B为热带假丝酵母按照5%（V/V）接种量，C为热带假丝酵母按照10%（V/V）接种量，D为热带假丝酵母按照20%（V/V）接种量；
每种接种比例设置3个重复，对苹果酒风味物质合成的影响进行探究。
表1 发酵比例
1.3.2 理化指标检测
还原糖、酸度、pH和酒精度的测定分别参考GB 5009.7——2016《食品中还原糖的测定》、GB 5009.239——2016《食品酸度的测定》、GB 5009.237——2016《食品pH值的测定》和GB 5009.225——2016《酒中乙醇浓度的测定》。
1.3.3 挥发性风味物质的测定
挥发性化合物的测定使用改良的叶萌祺[14]、李记明等[15]的方法。具体操作：采用顶空固相微萃取法（HS-SPME）进行香气成分的富集。移取5 mL苹果酒样品于15 mL顶空瓶中，加入2.8 g氯化钠和6 μL乙酸正戊酯（内标），在45 ℃条件下平衡10 min，顶空吸附45 min，进样，在250 ℃下解析2 min。色谱柱升温程序：起始温度40 ℃，保持5 min后以3 ℃/min升温升至120 ℃，以8 ℃/min升温至230 ℃，保持10 min，载气He，流速0.8 mL/min，分流方式为不分流；
质谱电子能量70 eV，离子源温度200 ℃，扫描范围33～450amu，灯丝流量0.25 mA，检测器电压350 V。
1.3.4 数据处理
利用Microsoft Office Excel 2010和Origin 2022b对理化指标和风味物质进行数据处理及分析；
使用R软件绘制挥发性风味物质网络图；
利用SIMCA-P 14软件建立偏最小二乘-判别分析模型，对风味数据进行可视化趋势分析，并筛选差异挥发性风味化合物。
2.1 酿酒酵母与Candida tropicalis不同接种比例下苹果酒理化指标的变化规律
滴定酸影响苹果酒的pH，继而影响到酵母细胞的繁殖能力、细胞活性、营养物质的吸收、产物的代谢与分泌[16]。不同接种比例下苹果酒理化指标的变化如图1所示，在酿酒酵母接种量相同的条件下，Candida tropicalis接种量增加，总酸和pH变化不明显，可滴定酸度含量范围为1.35～1.52 g/L，pH范围为3.73～3.79，适宜的苹果酒的pH范围应在3.20～3.80[17]。随着Candida tropicalis接种量增加，酒精度整体上呈先降再升趋势，但都低于酿酒酵母纯种接种的酒精度，混菌接种的还原糖整体上呈下降趋势，且都低于酿酒酵母纯种发酵的还原糖含量，可见加入Candida tropicalis降低酒精度，Xu等[18]通过顺序接种Saccharomyces cerevisiae和Hanseniaspora valbyensis混菌发酵试验将酒精浓度降低25.06%～51.38%。
图1 不同接种比例下苹果酒理化指标的变化
2.2 酿酒酵母与Candida tropicalis不同接种比例下苹果酒挥发性风味物质比较
由酿酒酵母与Candida tropicalis不同接种比例下苹果酒挥发性风味物质的组成及相对含量如图2所示。通过热图对苹果酒风味成分可视化分析可知，苹果酒中共鉴定出38种挥发性化合物，包括7种酸、15种醇、7种酯、8种羰基化合物和2种萜烯类化合物。通过聚类分析可知，将样品聚类为2类，分别为：1∶0，1∶0.5，1∶1.0和1∶2.0；
显然，不接种Candida tropicalis和接种Candida tropicalis的苹果酒挥发性风味物质明显区分。将风味物质聚类为4类，分别为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ。酿酒酵母纯种发酵下苹果酒中第Ⅱ类风味物质相对含量明显高于其他组，第Ⅱ类风味物质主要包括乙酯类化合物；
乙酯类化合物是苹果酒中重要的酯类化合物，大多呈现花香和果香，给酒体带来怡人香气[15]。酿酒酵母与Candida tropicalis接种比例1∶0.5时，苹果酒中第Ⅲ类风味物质相对含量明显高于其他组，第Ⅲ类风味物质主要为乙酸乙酯和高级醇；
产香酵母是最重要的乙酸乙酯产生菌[19]，刘婷婷等[20]从发酵堆积料和出池酒醅中获得1株乙酸乙酯产生菌Candida tropicalisZ4；
高级醇主要通过酵母菌的酒精发酵途径或氨基酸降解途径生成，作为次级代谢产物释放至酒体中[21]，适量的高级醇类物质可以赋予酒体愉快的香气，过量的高级醇则会导致酒质下降，其中苯乙醇及其酯类和低级脂肪酸构成苹果酒香气的基本骨架[22]。酿酒酵母与热带假丝酵母接种比例1∶1时，苹果酒中第Ⅰ类风味物质相对含量明显高于其他组，其中乙酸异戊酯是苹果酒中重要的乙酸酯，乙酸异戊酯呈果味、类似香蕉味[15,23-24]；
3-甲硫基丙醇可以赋予猕猴桃酒更强烈的果香[25]；
2, 3-丁二醇具有奶油香，是酒中极少数能够呈香的多元醇之一[15]。酿酒酵母与Candida tropicalis接种比例1∶2时，苹果酒中第Ⅳ类风味物质相对含量明显高于其他组，其中3-羟基丁酸乙酯在葡萄酒中对水果香气的感知具有增强作用[26]，呋喃类化合物是糖降解和美拉德反应的典型产物[27]。可见，酿酒酵母纯种发酵下，以乙酯类化合物的合成为主；
而Candida tropicalis添加则主要影响乙酸乙酯、乙酸异戊酯、高级醇和呋喃类化合物的合成。
图2 不同接种比例下苹果酒挥发性风味物质的热图分析
2.3 酿酒酵母与Candida tropicalis不同接种比例下苹果酒挥发性风味物质伴生关系
为研究不同接种比例对挥发性代谢物之间关联的影响，基于共现性网络分析分别构建4个不同接种比例下的挥发性风味网络，进一步了解挥发性风味物质间的伴生关系。如图3所示，A组的网路中共存在24种挥发性风味物质和127条互作关系，共被划分为3个模块，占比分别为54.17%，33.33%和12.5%，正丙醇、乙酸异戊酯、12-冠醚-4具有较高的度，可以反映这3种挥发性风味物质与较多挥发性风味物质具有关联。B组的网路中共存在28种挥发性风味物质和197条互作关系，共被划分为3个模块，占比分别为60.71%，28.57%和10.71%，糠醇与较多挥发性风味物质具有关联。C组的网路中共存在35种挥发性风味物质和277条互作关系，共被划分为4个模块，占比分别为31.43%，28.57%，22.86%和17.14%，乙醛、甲基庚烯酮、正己醇、乙酸苯乙酯、苯乙醛、正辛酸和（±）-6-甲基-5-庚烯基-2-醇与较多挥发性风味物质具有关联。D组的网路中共存在34种挥发性风味物质和297条互作关系，共被划分为3个模块，占比分别为41.18%，35.29%和23.53%，甲基庚烯酮、苯乙醛、2, 3-丁二醇和3-甲基-1-戊醇与较多挥发性风味物质具有关联。酿酒酵母与Candida tropicalis不同接种比例混菌发酵对风味物质相互作用有较大影响，随着Candida tropicalis接种量的增加，苹果酒风味物质的复杂性增加。这与Satora等[9]、Liu等[10]和曾朝珍等[11]的结果相似，产香酵母的加入有利于增加苹果酒香气成分的复杂性。
图3 不同接种比例下苹果酒挥发性代谢物共现性网络
2.4 酿酒酵母与Candida tropicalis不同接种比例下苹果酒挥发性风味物质与理化指标相关性分析
对不同接种比例的苹果酒的差异风味物质进行筛选，以VIP值大于1为标准，确定不同发酵条件下有显著差异的挥发性风味物质20种，如图4（a）所示，包含2, 5-二甲酰基呋喃、5-甲基呋喃醛、正己酸乙酯、正辛酸、5-羟甲基糠醛、（±）-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、辛酸乙酯、正丙醇、乙酸苯乙酯、异丁醇、癸酸乙酯、异戊醇、2-甲基丁酸、乙酸乙酯、正丁醇、正丁酸、乙醇、正己醇、3-羟基丁酸乙酯、苯乙醇。其中，2, 5-二甲酰基呋喃、5-甲基呋喃醛、正己酸乙酯是差异最大的前3种挥发性风味物质。
图4 不同接种比例下苹果酒差异风味物质与理化指标的冗余分析
为进一步解析不同接种比例下苹果酒主要差异风味物质与理化相关性，进行RDA冗余分析，如图4（b）所示。pH与2, 5-二甲酰基呋喃、5-甲基呋喃醛、5-羟甲基糠醛和正丁酸呈正相关性，与其他大多数差异风味物质呈负相关性；
总酸（TTA）与2, 5-二甲酰基呋喃、5-甲基呋喃醛、5-羟甲基糠醛和正丁酸、3-羟基丁酸乙酯、正丁醇、正丙醇、异丁醇呈正相关性，与其他大多数差异风味物质呈负相关性；
还原糖（RS）与正己酸乙酯、正辛酸、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、（±）-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、异戊醇、2-甲基丁酸、乙酸乙酯、乙醇、正己醇和苯乙醇呈正相关性，与其他差异风味物质呈负相关性。假丝酵母属、德尔布有孢圆酵母和毕赤酵母属等产香酵母，可直接参与生化反应或调节风味物质的形成，赋予酒体独特的香气[28]。不同接种比例下苹果酒主要差异风味物质与理化的相关性分析进一步解析Candida tropicalis对苹果酒风味物质合成的影响。
通过改变酿酒酵母和Candida tropicalis混菌发酵接种比例，测定苹果酒相关理化指标和挥发性风味物质。热图聚类结果表明：酿酒酵母和Candida tropicalis不同接种比例下苹果酒中共鉴定出38种挥发性风味物质，酿酒酵母纯种发酵下，共鉴定出24种挥发性风味物质，乙酯类化合物相对含量较高；
酿酒酵母与Candida tropicalis接种比例1∶0.5时，共鉴定出28种挥发性风味物质，乙酸乙酯和高级醇相对含量较高；
酿酒酵母与Candida tropicalis接种比例1∶1时，共鉴定出35种挥发性风味物质，乙酸异戊酯、3-甲硫基丙醇和2, 3-丁二醇相对含量较高；
酿酒酵母与Candida tropicalis接种比例1∶2时，共鉴定出34种挥发性风味物质，3-羟基丁酸乙酯和呋喃类化合物相对含量较高。共线性网络分析结果表明，Candida tropicalis的加入提高苹果酒风味物质的复杂性。相关性分析结果表明，Candida tropicalis可参与或调节风味物质的形成。试验结果为后续产香酵母在苹果酒酿造中的应用提供了基础数据。