郭方圆，张方方，孙 悦
（1.宁夏大学 食品与葡萄酒学院，宁夏银川 750021；
2.安琪酵母股份有限公司，酵母功能湖北省重点实验室，湖北宜昌 443000）
在葡萄酒酿造过程中，酵母影响葡萄酒的风味，其中非酿酒酵母被越来越多的研究者所重视。不同地域葡萄酒的独特口感和香气差别主要源于各地区独特的非酿酒酵母。因此，找到区分不同非酿酒酵母菌株的鉴别方法，确定相应的非酿酒种属，可为研究各类非酿酒酵母的理化特性和提升葡萄酒酿造水平打下基础。本文通过介绍几种DNA分子标记方法的原理和优缺点，探讨其在非酿酒酵母菌株区分中的应用状况与前景。
1.1 RAPD技术在非酿酒酵母菌株区分中的应用
随机扩增多态性DNA法（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）是一种DNA多态性检测技术。RAPD的原理是以不同菌株的基因组DNA为模板，采用随机的寡聚核苷酸为引物，在热稳定DNA多聚酶的作用下，对基因组PCR扩增，可以检测到整个基因组的DNA，显示出不同菌株之间的差异。
LOPANDIC等[1]用RAPD技术对Metschnikowia的10个种进行研究，RAPD-PCR指纹图谱支持了该属在种水平的分离。李冬梅等[2]以RAPD技术可以明确鉴别Candida albicans和Candida tropicalis种内差异。徐勇等[3]采用RAPD技术成功对Candidasp、Pachysolen tanophilu、Pichi stipit不同种进行区分。
1.2 RAPD优缺点
RAPD技术简单且效率高，短时间内可获得大量DNA多态性片段。该技术在特异性方面表现突出，可检测到单个碱基的置换；
在反应引物方面，无须专门设计相关引物就可以使用；
在购买成本方面，由于使用量少，成本较为低廉。此外，RAPD技术可以直接对所检测的DNA多态性进行分析。但RAPD技术复性温度低、特异性较低、PCR循环次数因引物浓度不同而不同和基因组DNA复杂等，因而重复性较低，易受外界DNA污染的干扰。此外，引物的筛选和反应条件的优化往往也需要花费较多的时间。
2.1 FT-IR在非酿酒酵母菌株区分中的应用
傅里叶变换红外吸收光谱学（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FT-IR）于20世纪90年代开发，用于微生物的鉴定和表征，其工作原理是红外辐射由光源发射，并通过干涉仪穿过样品，产生干涉条纹。“干涉图”由探测器记录为信号，然后将其放大，最后将其传输到计算机中，在计算机中执行傅里叶变换并将干涉图转换为光谱。
GRANGETEAU等[4]使用FT-IR技术从58株Candida.zemplinina分离株中鉴定出19株不同菌株。宋雅迪等[5]采用FT-IR技术对6种高渗酵母（Saccharomyces cerevisiae、Meyerozyma caribbica、Wickerhamomyces anomalus、Torulaspora delbrueckii、Crytococcus magnus、Sporobolomyces roseus）进行分类。
2.2 FT-IR优缺点
FT-IR光谱的优点为实验速度快，易于使用，对所测样品没有损伤，不产生污染；
光谱质量高，通透性好，灵敏度高；
对所有微生物具有普遍适用性，应用范围广；
光谱扫描范围宽；
具有表征非酵母种内生物多样性的能力和鉴别许多菌株的可能性。但光谱相对较敏感，易受到外界环境和实验仪器的影响，在进行相关定性分析时，会有相应的限制，影响了FT-IR光谱的应用范围和应用领域。
3.1 TRtRNA指纹图谱法在非酿酒酵母菌株区分中的应用
串联重复tRNA（Tandem Repeat-tRNA，TRtRNA）指纹图谱法考虑到串联重复序列随机分散在所有真核生物基因组中，tRNA基因保守且存在于不同染色体中的几个拷贝基因中，这是基于串联重复序列的不同寡核苷酸与基于保守tRNA区域的第二个寡核苷酸相结合的方法。
BARQUET等[6]通过TRtRNA指纹图谱法实现了H.vineae、H.uvarum和H.opuntiae种间和种内差异性分析。田进等[7]采用TRtRNA指纹图谱法研究118株野生有孢汉逊酵母属酵母菌，测出该属种内差异。王春晓等[8]采用26S rRNA基因D1/D2区域序列分析方法将59株酵母菌鉴定为6个酵母菌种，并采用串联重复tRNA指纹图谱法展示了17个基因型。
3.2 TRtRNA指纹图谱法优缺点
TRtRNA指纹图谱法流程相对简单，整体流程可重复，对非酿酒酵母具备较高的鉴别能力；
相对于扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）技术，TRtRNA指纹图谱法对DNA的质量和数量的要求低，技术相较而言更为简单。但tRNA基因随机分散，单独使用串联重复序列基因对非酿酒酵母的鉴定能力较低。同时，某些菌株的TRtRNA指纹图谱单一，未展现TRtRNA指纹图谱差异。
4.1 AFLP在非酿酒酵母菌株区分中的应用
AFLP是一种基于聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增检测基因组限制性片段的高分辨基因分型工具。通常在变性聚丙烯酰胺凝胶上扩增和检测50～100个限制性酶切片段。ESTEVEZARZOSO等[9]采用AFLP技术从一次自发发酵中分离出180个菌落，H uvarum分为11种不同的菌株，H vineae分为6种不同的菌株：C zemplinina分为4种不同的菌株。ALBERTIN等[10]采用AFLP技术对47株H.uvarum进行研究，结果表明AFLP可以有效进行H.uvarum菌株水平的差异分析。
4.2 AFLP的优缺点
AFLP方法已被证明对酵母基因分型非常有用。与大多数其他分型技术相比，该技术更具鉴别性、多态性、可重复性和可靠性。在一个泳道中揭示许多多态性条带的能力是AFLP标记的主要优点，且能同时分析凝胶上的许多条带，使得AFLP非常高效。该方法显示出较高的鉴别能力和良好的再现性，其能在物种和菌株水平上进行有效鉴别。然而，该技术的缺点是非常费力，片段分离需要大型、高度复杂的聚丙烯酰胺凝胶或自动测序仪，数据也难以进行相关分析处理，需应用复杂的生物信息学程序，这些特征限制了其在工业中的应用。
5.1 微卫星DNA标记在非酿酒酵母菌株区分中的应用
微卫星指“短DNA序列的重复”，根据微卫星序列两端的互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，根据分离片段的多态性区分不同的菌株。ALBERTIN等[11]使用微卫星分型技术对Brettanomyces bruxellensis菌株进行遗传分析，区分鉴定了18株中的13株。ALBERTIN等[12]通过开发8个微卫星标记，对110株菌株进行基因分型，110株供试菌株均显示独特的基因型。汪国庆等[13]使用微卫星技术对50株热带假丝酵母菌（Candida tropicalis）进行鉴定，经重复序列聚合酶链反应（Repetitive Extragenic Palindromic Polymerase Chain Reaction，REP-PCR）分型共得到7种REP-PCR型。
5.2 微卫星DNA分子标记的优缺点
微卫星DNA分子标记技术具有高重复性、多等位性、共显性遗传、广泛的基因组覆盖率、染色体特异性和PCR自动检测等特点，微卫星工具具有便携性，可以比较不同实验室的基因分型。微卫星具有高变异性，易于PCR扩增和解释，常用于区分分离株的标记物；
其拷贝数在个体间呈现高度变异，已成为基因组遗传图谱和物理图谱的理想界标，广泛应用于分析遗传多样性、确定品种间亲缘关系、个体识别等。
微卫星技术也有一定的不足：SSR位点的突变率高，对环境敏感；
SSR能够进行标记的位点有限，无法做到对功能基因全部标记，无法建立起成体系的遗传关系图谱；
操作复杂，过程烦琐；
SSR引物成本高，需进行大量开发和合成才能满足相关实验需要；
在进行测序凝胶时，会自动确定长度，因此会与真正的测序长度有差异，对碱基序列造成缺失等相关误差。
随着分子生物学的迅猛发展和新型仪器设备的应用，DNA分子标记技术在不断发展和更新。相对于传统形态学鉴别和现代生理生化分析技术，DNA分子标记技术因其多样性和准确性被越来越多地应用于非酿酒酵母菌的鉴定。
鉴于几种DNA分子标记技术都有其优缺点，其广泛适用性相对较差，不能以某一种技术区分所有的非酿酒酵母。因此，除部分非酿酒酵母可以被单一技术鉴别外，大部分非酿酒酵母的鉴别都需要使用不同的技术进行尝试，或结合两种及两种以上的方法，需要不同的序列分析等多个指标综合分析，才能获得正确结论。因此，对于非酿酒酵母的DNA鉴定方法，过程简单化、流程自动化、发展商业化是未来DNA分子标记技术的发展核心。虽然国内在非酿酒酵母遗传多样性方面的研究还相对较少，但可以预见，DNA分子标记技术在葡萄酒非酿酒酵母菌种的分类鉴定有着非常广阔的研究前景，在酵母菌株区分、菌种的鉴定、遗传多样性研究方面将发挥重要作用。
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