周 琴，刘新月，李绍仙，张晓花，谭文涵
（普洱市质量技术监督综合检测中心，云南普洱 665000）
花生油含有丰富的不饱和脂肪酸，其中油酸能降低低密度脂蛋白胆固醇水平，而不会破坏高密度脂蛋白，有助于维持血脂平衡，预防心血管疾病[1]。此外，油酸还具有抗炎、预防肥胖、预防衰老、预防动脉硬化和增强自身免疫力的功能[2-3]。然而，在对人体有益的同时，花生油也存在安全隐患。黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是造成花生油污染的主要原因之一[4]，在自然界中其主要以黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2存在，具有强毒性、致癌性、致畸性和致突变性，而黄曲霉毒素B1（AFB1）含量最高[5-6]。何景等[7]2019年在抽检北京小包装花生油时，黄曲霉毒素检出率为26.67%。胡振等[8]在对2016—2017年广西14个地级市抽检食用植物油样品时发现，花生油中黄曲霉毒素B1检出率达到8.85%，花生油合格率仅为87.83%。真菌毒素是对人和动物有严重慢性毒性的物质[9]，如果大量摄入或长期少量摄入黄曲霉毒素，可能会导致慢性中毒、增加致癌风险。因此，研究花生油中黄曲霉毒素B1的检测方法具有重要意义。
黄曲霉毒素检测方法有酶联免疫法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）[10]、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[11]等，酶联免疫吸附法简单、快速、特异性高，但假阳性较多；
高效液相色谱法具有良好的准确性和高灵敏度，但需要衍生，检测周期长，且较浪费溶剂。液相色谱-质谱-质谱联用仪（LC-MS/MS）特异性强，定性定量准确，检出限低，从而被广泛应用于农残、兽残以及真菌毒素类的痕量检测领域[12-15]。黄曲霉毒素的离子化状态可利用电喷雾离子源实现，电喷雾离子源有正、负离子两种模式，在正离子模式下效果最好[16]，因此，黄曲霉毒素离子化模式为ESI+。黄曲霉毒素净化小柱包括两个类型：多功能净化柱与免疫亲和柱。其中，多功能净化柱采用复合材料，可以吸附蛋白质、色素等[16]。尽管这种方法的净化速度相对较快，但不能全面有效地消除干扰物质。因此，在实际实验中，多使用免疫亲和柱来净化样品。本研究利用液相色谱-质谱-质谱联用仪对花生油中黄曲霉毒素B1进行定量分析，并对实验条件进行了探讨。
1.1 仪器与试剂
液相色谱-质谱-质谱联用仪（3200QTRAP，美国AB Scies）；
色谱柱（phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl 100A，100 mm×3.0 mm）；
3K15台式高速冷冻离心机（德国Sigma公司)；
涡旋搅拌混匀器（英国Grant公司）；
AL204电子天平（瑞士梅特勒）；
IKA HS501振荡器（德国IKA仪器设备有限公司）；
N-EVAP-24氮吹仪（美国Organomation公司)；
微量可调移液枪（0.1～1.0 mL，德国Eppendorf公司）。
花生油，购于沃尔玛超市。黄曲霉毒素B1（100 μg·mL-1，天津阿尔塔科技有限公司）；
黄曲霉毒素B1内标液（0.5 μg·mL-1，天津阿尔塔科技有限公司）；
乙腈（色谱纯，德国 Merck 公司）；
黄曲霉毒素B1免疫亲和柱（普瑞邦公司）；
质控样[MRM-AO，质控值范围为（12.44±1.38）μg·kg-1，普瑞邦]；
甲酸（分析纯，阿拉丁公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 标准使用液配制
准确移取1 mL浓度为100 μg·mL-1的标准储备液，用甲醇定容至10 mL，配制浓度为10 μg·mL-1的标准储备液，再准确移取1 mL浓度为 10 μg·mL-1的标准储备液用甲醇定容至10 mL，配制浓度为1 μg·mL-1的标准中间液，分别吸取1 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL和20 μL标准中间液于1 mL进样瓶中，并同时加入40 μL浓度为0.05 μg·mL-1的黄曲霉毒素B1内标液，用初始流动相定容至1 mL配制系列标准工作液浓度为1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、4.0 ng·mL-1、6.0 ng·mL-1、8.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1。
1.2.2 样品前处理
准确称取5 g试样于50 mL离心管中，加入20 μL浓度为1 μg·mL-1的黄曲霉毒素B1标准品和200 μL浓度为0.05 μg·mL-1的黄曲霉毒素B1内标液，加入20 mL乙腈-水溶液（80+20），涡旋混匀，置于振荡器振荡20 min，离心，取上清液备用。准确移取4 mL上清液，加入46 mL 0.1%吐温-20 PBS溶液混匀，将待净化液转移至50 mL注射器筒内，以恒定流速流经已活化的免疫亲和柱，20 mL超纯水淋洗免疫亲和柱，真空泵抽干。2 mL甲醇洗脱黄曲霉毒素B1免疫亲和柱，真空泵抽干全部亲和柱，在水浴条件下将洗脱液浓缩至近干，初始流动相定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，滤入样品瓶上机测定。
1.2.3 仪器条件
色谱条件：phenomenex Kinetex 2.6 μm Biphenyl-100A色谱柱（100 mm×3.0 mm，2.6 µm），进样量10.0 μL；
流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液；
柱温35 ℃，梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
质谱条件：离子化模式ESI+，电子能量70 eV；
离子源温度280 ℃；
接口温度280 ℃；
扫描方式多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。
2.1 仪器分析参数
将体积浓度为1 μg·mL-1的黄曲霉毒素B1和内标单标分别通过质谱仪所配的外置进样泵进样，分别寻找其母离子和子离子并优化碰撞电压和去簇电压。黄曲霉毒素B1及其内标在串联质谱上的检测参数见表2，黄曲霉毒素B1及其内标基质标准溶液的总离子流色谱图见图1。
图1 黄曲霉毒素B1及其内标基质标准溶液的总离子流色谱图
表2 黄曲霉毒素B1及其内标的LC-MS/MS检测参数
2.2 方法线性范围和检出限
在1.2.3仪器条件下，根据1.2.1配制的系列标准工作液：1 ng·mL-1、2 ng·mL-1、4 ng·mL-1、6 ng·mL-1、8 ng·mL-1、10 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1进样分析；
工作曲线横坐标为目标物质量浓度C（ng·mL-1）；
工作曲线纵坐标为黄曲霉毒素B1峰面积与内标峰面积之比。图2为黄曲霉毒素B1标准曲线所拟合的线性方程。由图2可知该检测方法在1～20 ng·mL-1的质量浓度内线性关系良好，相关系数R2为0.999 3。
图2 黄曲霉毒素B1标准曲线
2.3 方法的准确度和精密度
在花生油空白基质中分别加入3个水平的黄曲霉毒素B1标准品，混匀1 min，使花生油空白基质与所加入的标准品充分接触后，加入200 μL浓度为0.05 μg·mL-1的黄曲霉毒素B1内标液，按1.2.2中的方法充分提取和净化后检测。每个进行6次平行实验，计算其平均回收率和相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD），以考察方法的准确度和精确度，结果见表3。
表3 花生油中黄曲霉毒素B1的加标回收率及其相对标准偏差（n=6）
由表3可知，在不同加标水平下，黄曲霉毒素B1的回收率在94.1%～107.4%，相对偏差（RSD）为5.6%～9.3%，回收率满足《实验室质量控制规范食品理化检测》（GB/T 27404—2008）食品理化检验中回收率要求即加标量小于0.1 mg·kg-1时回收率为60%～120%，相对标准偏差小于15%。表明该方法的回收率和精密度满足花生油中黄曲霉毒素B1残留检测的要求。
2.4 质控样测定
将所购质控样采用该方法进行测定，测定结果为13.12 μg·kg-1，质控样质控值为（12.44±1.38）μg·kg-1，测定值在质控值范围内，表明该方法对花生油中黄曲霉毒素B1阳性样品的测定具有较高的准确性，适用于实验室中花生油中黄曲霉毒素B1的准确定量分析。
本研究建立了花生油中黄曲霉毒素B1的LCMS/MS测定方法，样品前处理采用免疫亲和柱技术，该方法无需进行衍生，简便快捷、灵敏度高，特异性强、准确度和精密度均满足定量分析的要求。在1～20 ng·mL-1线性内呈良好线性关系（R2为0.999 3），在2.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1的加标水平下，回收率在94.1%～107.4%，相对标准偏差（n=6）为5.6%～9.3%，采用该方法测定花生油中黄曲霉毒素质控样，检测结果在质控样质控值范围内。因此，该方法可用于花生油中黄曲霉毒素B1的快速检测。
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