赵秋菊 崔学强 邓杰玲 黄昌艳 李佳蔚 张自斌
关键词：石斛兰；
iPBS 标记；
杂交子代；
真实性鉴定
中图分类号：S682.31 文献标识码：A
石斛兰（Dendrobium）为多年生草本植物，是兰科（Orchidaceae）石斛属所有植物的总称[1]，根据花期不同，可将其分为春石斛和秋石斛两大类。石斛兰的花朵具有独特的“斛状”花形，色彩绚丽且花期长，观赏价值极高。除此之外，石斛兰还具有重要的药用价值，其中铁皮石斛（D.officinale）、金钗石斛（D. nobile）、霍山石斛（D.huoshanense）等品种是我国传统中药材，具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖等功效[2-3]，其药用价值在《中药本草经》和《本草纲目》等中药典籍均有记载[4]。
1856 年，英国的JOHN DOMINY 等将虾脊兰属的2个不同种虾脊兰进行杂交，将子一代成功培育开花[5]，至此，兰花杂交育种开启了新篇章。杂交育种是培育石斛兰新品种的主要方法，目前，人类已经成功培育出涉及多达6 个属的人工属间杂交种[6]。但石斛兰的育种周期较长，从筛选亲本到子代培育成熟，整个繁殖周期通常需要几年的时间，需花费大量的时间与精力从数个杂交后代中进行选择。为了减少人力物力的浪费，缩短杂交育种的周期，杂交子代株系真实性的早期鉴定显得十分重要。辨别杂交子代真实性能更好地筛选优质种，缩短选种时间，对石斛兰的育种工作具有重要意义。
早期的杂交子代真实性鉴定主要通过形态学方法、细胞学鉴定和同工酶标记进行鉴定[7]，但形态学方法易受主观因素影响，细胞学鉴定要求技术较高，同工酶标记也存在位点少、多态性低的缺点。分子标记是继形态学鉴定、细胞学鉴定和同工酶标记之后发展起来的新式鉴定方法，随着分子生物学的发展，越来越多的分子标记被应用于杂种子代的鉴定中。近年来，常应用于杂种子代鉴定工作中的分子标记主要有：ISSR[8-9]、SSR[10-11]、SRAP[12-13]等，但未见iPBS 标记应用于鉴定杂种子代真实性的相关报道。iPBS 是一类基于反转录转座子的新型分子标记[14-15]，相对于其他分子标记，iPBS 标记具有无需预先获得LTR序列，技术手段简单、高效，应用范围广的特点[16]，在种质资源鉴定、亲缘关系分析和遗传多样性分析等研究中更具优势。因此，本研究基于iPBS标记，鉴定广美石斛（Dendrobium Pittero Gold‘Diamond Ring）×黄钻戒石斛（DendrobiumBtilliant Smile‘Hiromi）杂交子代的真实性，为石斛兰杂交育种亲本的筛选和优质杂种子代的选育提供分子依据，从而加快石斛兰育种工作进程。
1 材料与方法
1.1 材料
本研究以广美石斛（ Dendrobium BtilliantSmile‘Hiromi）为母本，黄钻戒石斛（DendrobiumPittero Gold‘Diamond Ring）为父本进行杂交，通过人工授粉（无套袋）得到子一代，将亲本及其19 个杂交后代株系（编号：1～19）作为试验材料。供试材料均取自广西壮族自治区农业科学院花卉研究所石斛兰种质资源圃，父母本及杂交后代株系均剪取幼嫩叶片，立即保存于液氮中，用于提取DNA。
主要试剂：2×Easy Taq? PCR SuperMix（康为世纪生物科技有限公司）， Trans? 2K DNAMaker（北京全式金生物技術有限公司）；
50×TAE缓冲液（国拓生物科技有限公司），琼脂糖[生工生物工程（上海）股份有限公司]。
主要仪器：H1650-W 型常温离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），DYY-6D 型电泳仪（北京六一生物科技有限公司），GEL DOCXR 全自动凝胶成像系统（上海勤翔科学仪器有限公司），TC-96/G/H（b）C 型LifeECO 基因扩增仪（杭州博日科技有限公司），HWS-26 型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA 的提取和检测 供试样品基因组DNA 提取采用EasyPure? Genomic DNA Kit（北京全式金生物技术有限公司）试剂盒提取，提取的DNA 用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用紫外分光光度计检测其浓度和纯度，提取的DNA 用TE 缓冲液稀释浓度至20 ng/μL，置于–20 ℃条件下保存备用。
1.2.2 引物筛选及iPBS-PCR 扩增 本研究引物选用KALENDAR 等[17]发表的83 个引物，从合成引物中选取扩增条带清晰，稳定性强，多态性高的引物对供试样品DNA 进行PCR 扩增（表1）。PCR 反应体系为20 μL，包含10 μL 2×Easy Taq?PCR SuperMix，8 μL 无菌水，1 μL 引物，1 μL模板。iPBS-PCR 扩增程序为：94 ℃预变性4 min；
94 ℃变性1 min，50 ℃退火45 s，72 ℃ 2 min，35 个循环；
72 ℃延伸10 min，扩增产物置于4 ℃冰箱保存。PCR 扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.2.3 杂种子代真实性鉴定 利用筛选出的引物对父母本及杂交后代株系进行iPBS-PCR 扩增，扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。根据电泳图谱，对比父母本条带，鉴别杂种子代中的真杂种。参照大多数研究的标准，以子一代电泳条带中含有父本特征带的植株鉴定为真杂种，反之为假杂种。为保证最终鉴定结果的准确性，在研究中至少有2 个或2 个以上的引物鉴定为真杂种才能判定该子代植株为真杂种[18]。
1.3 数据处理
观察扩增产物电泳图谱，统计清晰的DNA条带，同一迁移位置上，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，经Excel 软件构建原始“0， 1”二元矩阵。利用NTSYS-pc 2.10e 统计软件进行数据分析， 采用SHAN Clustering 程序进行UPGMA（算数平均数不加权对组法）聚类分析，构建树状聚类图，并用DICE 法计算试供材料间的遗传相似系数。
2 结果与分析
2.1 iPBS 引物扩增多态性分析
从83 条iPBS 引物中筛选7 条扩增条带清晰、多态性高、重复性好的引物对亲本及子代共21 份石斛兰基因组DNA 进行PCR 扩增。扩增结果表明（表1），7 条引物扩增出的总条带为69 条，多态性条带51 条，多态性比率为73.91%，其中引物2218 扩增条带多态性比率最高，为100%，引物2224 和2255 扩增条带多态性比率最低，为62.5%。每条引物扩增出的平均条带数为9.86 条，平均多态性条带为7.29 条。引物2224 对21 份石斛兰基因组DNA 的扩增结果如图1 所示。
2.2 杂合后代株系真实性鉴定
利用筛选的7 条引物对19 个杂交子代进行真实性鉴定，对比亲本与子代电泳图谱（图2），以引物2255 扩增图谱为例，能扩增出父本特征性条带的即为真杂种，未扩增出父本特征带或只扩增出母本特征带的子一代植株可能为母本自交后代或者认定为假杂种。结果表明（表2），引物2081、2241、2255 扩增出具有父本特征性条带的子代个数分别为10、10、14，鉴定效率分别为52.6%、52.6%、73.7%。在引物2081 和2241 的鉴定中，4、10、16 和17 号均未扩增出父本特征带，但在引物2271、2076、2218 和2224 的进一步鉴定中，发现4、10、16、17 这4 株子代植株都扩增出了父本特征性条带，鉴定为真杂种。
此外，在鉴别杂种子代时，每条引物均能扩增出了1～2 条父本特征带，但引物2076 扩增出的父本特征带最多，为4 条。综合7 条引物的扩增结果来看，广美石斛与黄钻戒石斛杂交所得的19株子代植株均能扩增出父本特征性条带，即全为真杂种，7 条iPBS 引物的鉴定效率高达100%。
2.3 亲本与子代的聚类分析
利用NTSYS-pc 2.10e 统计软件对遗传矩阵按UPGMA 进行聚类分析，构建石斛兰亲本及杂交后代株系的树状聚类图，分析亲本与杂交后代株系间的遗传关系（图3）。结果显示，在遗传距离0.82 处，亲本及19 株杂交后代株系可分为5 大类群，其中，第Ⅰ类包括父本及11 个子代植株，分别为2、3、5～9、11、13、14、18 号植株，占供试材料的52.38%；
第Ⅱ类为包括4 个子代植株，分别为10、15～17 号；
第Ⅲ类为母本及4 号子代植株，第Ⅳ类仅有19 号子代植株，第Ⅴ类为1 号与12 号子代植株。其中，父本与6 号子代的遗传距离最近，母本与4 号子代的遗传距离最近；
子一代中，7 号与11 号的遗传距离最近。从聚类结果来看，绝大多数子代植株均聚类在父母亲本之间，这部分子代植株先聚为2 个分支，先与父本聚合为一类，再与母本聚合，说明相较于母本，子一代植株与父本的亲缘关系更近，表现出倾父本遗传。
2.4 亲本与子代的遗传相似系数分析
利用NTSYS-pc 2.10e 统计软件计算21 份石斛样本间的遗传相似系数，结果显示，亲本及子代之间的遗传相似系数变幅为0.71～0.93。父本黄钻戒石斛与母本广美石斛之间的遗传相似系数仅为0.71，是遗传相似系数矩阵中的最低值。根据所得遗传相似系数用Excel 2010 软件构建亲本及子代的遗传相似系数箱式图（图4），发现父本黄钻戒石斛与子代之间的遗传相似系数在0.75～0.88 之间，平均值为0.83，其中父本与4 号子代的遗传相似系数最低，与7 号子代的遗传相似系数最高。母本广美石斛与子代之间的遗传相似系数为0.72～0.84，平均值为0.80，其中母本与12号子代遗传相似系数最低，与10 号子代遗传相似系数最高。子代间的遗传相似系数为0.73～0.93，平均值为0.82，其中18 号子代与19 号子代遗传相似系数最低，而7 号与11 号子代的遗传相似系数最高。从整个遗传相似系数矩阵来看，父本与子代间的遗传相似系数比母本与子代间、子代间的更高，这表明杂交子代更偏向于父本遗传，这与聚类分析时杂交子代与父本的亲缘关系更近的结果一致。
3讨论
杂种子代的鉴别工作对于遗传育种十分关键，它可以通过子代基因型预测子代植株的表型性状，极大地提高了育种效率，缩短杂交育种的周期，有助于发现子代中具有杂种优势的新品种。传统的鉴别方式是形态学鉴定，但对于一些表型性状差异不大的物种，光靠形态学鉴定并不准确，而分子标记技术的发展，在基因组DNA 的水平上，为鉴别杂种子代的真实性提供了可靠的分子依据。
iPBS 作为新型分子标记，近年来逐渐被应用于多种物种的种质资源的鉴定以及遗传多样性分析等研究中。在本研究中，选取清晰、重复性好、多态性高的7 条引物对试供样本进行iPBS-PCR扩增，共检测到69 条谱带，其中多态性条带为51 条，多态比例为73.91%。相较于ISSR[19]、SSR[20]、SRAP[21-22]、AFLP[23-24]等分子标记技术对石斛兰扩增的引物多态性，iPBS 分子标记的引物多态性略低，但仍在70%以上，研究证明，iPBS分子標记的扩增多态性较好，可应用于种质资源鉴定、遗传多样性分析以及杂交子代真实性鉴定等研究中。
种质资源的鉴定是育种工作的基础，对种质间的亲缘关系和遗传多样性进行分析，有助于选配优质杂交亲本，选育具有杂种优势的后代株系。遗传相似系数矩阵揭示了子代与亲本之间的相似程度， 两亲本与子代间遗传相似系数为0.71～0.93，变幅不大，表明该杂交组合子代间的遗传多样性并不丰富[25]，这不利于杂种优势品种的出现，后续研究中应选取具有较大遗传差异的植株进行杂交育种，以便获取杂种优势品种。而子代间遗传相似系数数值偏高，说明该杂交组合子代株系遗传基础趋向偏窄[26]。聚类分析图直观显示了杂交子代株系与双亲间遗传距离的远近，大部分子代株系表现为倾父本遗传，聚类分析鉴定结果与遗传相似系数鉴定结果一致。但1、12、19 三株子代独立为2 个分支，并与父母本以及其余子代植株遗传距离较远，存在明显的遗传分离现象，其原因可能是子代发生了较大的基因突变或重组变异[18， 27]。
本研究中，子一代植株扩增出大量的父本特征带，子代偏向父本黄钻戒石斛遗传，这与大部分研究如林榕燕等[28]、李玉萍等[29]的研究中子代株系均表现为倾母本遗传的结果相反，说明较多的黄钻戒石斛遗传信息被导入子代个体中，表现出较为明显的倾父本遗传。经7 条引物共同鉴定，19 株子代株系均为真杂种，鉴定效率为100%，这与林榕燕等[26]基于SSR 标记和SRAP 标记对文心兰杂交后代进行真实性鉴定的鉴定效率一致，略高于铁皮石斛[30]、结缕草[31]、假俭草[32]、猕猴桃[33]等物种的鉴定效率。研究证明，iPBS 标记是鉴别杂种子代真实性的有效手段，可应用于植物种质资源的鉴定、亲缘关系的研究以及遗传多样性的分析等研究工作中。虽然一种分子标记可单独鉴别出所有杂种，但由于石斛属植物类群较大且遗传背景较复杂，仅凭一种标记鉴定可能还不够准确，在今后的研究中可增加形态学鉴定或者联合多标记鉴定来辅助进行杂种鉴定。