潘雅朦，康雨彤，蔡晓翠，张思蓉，贺金华*（. 新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 8300；
. 新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 83000）
支气管哮喘简称为哮喘，严重影响患者生活质量。哮喘是一种以慢性气道炎症为特征，由多种炎性细胞如淋巴细胞、嗜酸性粒细胞以及细胞组分共同参与的气道疾病[1]，其中T淋巴细胞起着非常重要的作用。在哮喘免疫异常发病过程中，Thl、Th2、Thl7和Treg细胞比例失衡以及细胞因子效应失调扮演着重要角色，Th1/Th2以及Th17/Treg免疫失衡是哮喘发病的重要免疫学机制[2]。
在Th1、Th2、Th17和Treg细胞的分化过程中，Notch发挥着重要作用[3]。Notch信号通路包括4种Notch受体（包括Notch3）和5种Notch配体（包括Delta1和Delta4），它们表达在T细胞和多个成熟免疫细胞的表面，同时参与T细胞的分化。当Notch受体结合配体后，下游产物被激活以抑制分化调节因子的表达，从而影响T细胞的发育过程[4]。研究证实，Notch信号通路的异常活化与哮喘中Th1/Th2的免疫失衡密切相关，能够调节哮喘Th1/Th2平衡[5]；
Treg细胞可以通过Delta4-Notch信号通路来改善气道重塑[6]。CD4＋T细胞表达的Notch3与Delta1结合，促使Th0向Th1细胞分化，从而减弱Th2型免疫反应；
Treg细胞表达的Notch3与Delta4结合，可减少肺内新生血管生成[7-8]。STAT信号通路在哮喘发病过程中也发挥重要的调控作用。当肺部感染时，存在Th17/Treg失衡以及STAT3和STAT5信号通路的异常表达[9]。STAT3和NF-κB能协同调节多个细胞因子和趋化因子，在慢性炎症中发挥重要作用[10]。STAT6激活后通过JAK-STAT6通路介导哮喘炎症反应和气道高反应性[11]。有研究表明通过抑制JAK1/STAT6通路能够改善哮喘的气道黏液分泌失衡，从而达到缓解症状的效果[12]。
本课题组前期研究发现神香草提取物（JAX2）能减轻肺组织支气管周围、血管周围的Eos浸润，减少黏液的过度分泌，降低哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中TNF-α、IL-4及血清中特异性IgE的含量，升高IFN-γ含量，对哮喘小鼠气道炎症具有显著的抑制作用；
JAX2作用于脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7细胞后能显著降低一氧化氮（NO）的释放、抑制TNF-α和IL-6的表达，增加细胞内活性氧（ROS）浓度；
并且能够显著抑制乙酰胆碱、组胺导致的气管平滑肌收缩，缓解支气管痉挛。T淋巴细胞亚群、细胞因子效应失调在哮喘免疫异常发病中扮演着重要角色，而介导T细胞间及胞内传递信息的信号转导通路在疾病发生发展过程中作用尤为重要。因此，本研究建立小鼠哮喘模型，观察JAX2对哮喘小鼠肺组织Notch/STAT信号通路蛋白表达的影响，进一步探讨JAX2治疗哮喘免疫失衡的机制。
1.1 实验动物
雌性健康Balb/c小鼠，共42只，6～8周龄，体质量18～20 g。由新疆医科大学动物实验中心提供，常规饲养于新疆药物研究所动物房，温度20～25℃，湿度50%～60%，自由摄食及饮水，动物许可证号：SYXK（新）2022-0002。
1.2 试药与仪器
神香草经新疆药物研究所何江研究员鉴定为唇形科植物硬尖神香草Hyssopus cuspidatusBoriss.的干燥地上部分，提取物由新疆药物研究所制备；
卵清白蛋白（OVA，Sigma）；
氢氧化铝胶生理盐水（哈药集团生物有限公司）；
Delta4抗体（美国R&D公司）；
STAT3、P-STAT3抗体（美国CST公司）；
Delta1（ab10554）、Notch3（ab23426）、STAT6抗体（ab263947）（美国Abcam公司）；
小鼠IL-10 ELISA试剂盒（美国赛默飞公司）；
小鼠IL-4（abs520003）、IL-17（abs520009）、IFN-γ（abs520007）ELISA试剂盒（上海爱必信公司）；
全自动脱水仪（TP1020）、石蜡包埋机（EG1150H）、手转轴式切片机（RM2235）（德国莱卡）；
流式细胞仪（美国BD公司）。
1.3 JAX2制备
神香草干燥地上部分用50%乙醇加热回流提取，再经过减压浓缩、干燥，将干浸膏用水混悬后经聚酰胺树脂分离纯化，收集40%乙醇水洗脱液并浓缩、干燥，即得JAX2。JAX2主要含咖啡酸、咖啡酸甲酯、木犀草素7-O-α-L-吡喃鼠李糖（1→6）-β-D吡喃葡萄糖苷、香叶木苷、迷迭香酸、新西兰牡荆苷、三裂鼠尾草素、金丝桃苷、金合欢素、3，4-二甲氧基肉桂酸等黄酮类和酚类化合物[13]。课题组采用高效液相色谱法对提取物中主要活性成分迷迭香酸、总多糖和总黄酮进行了定量研究[14]。
1.4 哮喘模型的建立
模型组与各给药组小鼠分别于实验第1、8日腹腔注射10%OVA致敏液0.2 mL致敏；
空白组于实验第1、8日腹腔注射0.2 mL生理盐水代替OVA溶液。从第15日起，将小鼠置于雾化箱内，模型组、给药组小鼠用压缩雾化器喷入OVA溶液激发哮喘，空白组雾化喷入生理盐水，每日1次，每次30 min。小鼠出现呼吸和运动失常，连续刺激后小鼠状态持续变差，出现呼吸困难，躁动，动作迟缓，食欲不振为造模成功。
1.5 分组及给药
42只小鼠随机分为空白组，模型组，JAX2（高、中、低剂量）组，肺宁片组和地塞米松组，每组6只。给药组小鼠从第15日开始分别给予相应药物治疗1 h后雾化刺激30 min，每日1次。
1.6 标本采集
末次激发24 h后，快速摘去小鼠右眼球，按压腹部，使血液尽可能完全滴入抗凝管中。小鼠取血后，暴露并剪开气管，将1 mL注射器针头插入气管内并固定。每次注入0.5 mL生理盐水回吸，总共灌洗3次（回抽率为80%～90%），将收集到的BALF于4℃、1500 r·min－1离心2次，每次10 min，取上清液置－80℃保存备用。迅速打开胸腔，暴露肺及心脏，摘取肺组织，用4℃的生理盐水冲洗干净后，使其完全浸透在4%多聚甲醛中固定后备用。
1.7 小鼠外周血淋巴细胞中T细胞数量及比例测定
利用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），细胞计数后，取适宜浓度细胞悬液待用。① Th1、Th2、Th17细胞检测：取细胞悬液加入细胞刺激剂，置于培养箱中孵育4 h后，洗涤1次，加入CD4抗体，4℃避光孵育15 min后，加入破膜剂孵育30 min；
再加入IFN-γ、IL-4、IL-17抗体，4℃避光孵育30 min后，用PBS洗1次，重悬后上机检测。② Treg细胞检测：取细胞悬液加入CD4、CD25抗体，4℃避光孵育20 min后，加入破膜剂孵育30 min；
接着加入FOXP3抗体避光孵育20 min，洗涤2次，重悬后上机检测。
1.8 肺组织中受体/配体蛋白的表达
采用免疫组化染色，将肺组织切片烘片、脱蜡、水化、封闭、抗原修复后滴加对应的一抗，置于干燥箱内37℃下孵育1.5 h，再用PBS洗3次，每次5 min；
滴加二抗，于37℃下继续孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；
加入SABC，37℃下恒温30 min，PBS洗3次，每次5 min；
加入二氨基联苯胺（DAB）显色5～8 min后，用自来水冲洗2 min终止显色；
用苏木精染色冲洗后封片。在光学显微镜下观察各组小鼠肺组织切片的染色情况及蛋白在肺组织切片中的分布情况，记录各组数据。
1.9 BALF中细胞因子的含量检测
采用ELISA法检测IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17的水平，酶标仪测定OD值，根据样品OD值算出相应样品的含量。
1.10 统计学方法
采用GraphPad Prism 8软件进行分析，数据以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，数据不符合正态分布时，采用非参数检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。两个变量服从正态分布，其相关性用Pearson相关分析；
若不符合正态分布，其相关性采用Spearman相关分析。
2.1 一般行为学变化
模型组小鼠毛发直立稀疏、枯燥无光泽，呼吸急促常伴有喘息、抓耳挠腮，连续雾化后小鼠呼吸频率增加，精神逐渐变差，多数出现咳嗽现象，烦躁不安，反应迟钝，食欲减少；
与模型组相比，治疗组小鼠激发后出现呼吸频率增加，喘息等现象，经过治疗，食欲增加，呼吸和喘息频率下降，毛发有光泽，偶尔咳嗽，症状减轻；
空白组小鼠毛发油亮，呼吸正常，情绪稳定，食欲良好。
2.2 Th1、Th2细胞比例及Th1/Th2比值
模型组Th2细胞占CD4＋T淋巴细胞比例显著高于空白组，Th1细胞占CD4＋T淋巴细胞比例较空白组无明显变化。JAX2组和阳性药组Th1细胞数量及Th1/Th2显著高于模型组，JAX2组Th2细胞数量显著低于模型组（见图1和图2）。
图1 小鼠Th1细胞（A）、Th2细胞（B）占CD4＋T淋巴细胞百分比（%）Fig 1 Percentage of Th1（A） and Th2 （B）cells in mice CD4＋T lymphocytes（%）
图2 小鼠Th1细胞、Th2细胞比例及Th1/Th2比值变化Fig 2 Changes in the proportion of Th1 and Th2 cells and the ratio of Th1/Th2 in each group of mice
2.3 Th17、Treg细胞比例及Th17/Treg比值
模型组Th17细胞占CD4＋T淋巴细胞比例与Th17/Treg均显著高于空白组；
模型组Treg细胞占CD4＋T淋巴细胞比例较空白组无明显变化。JAX2组和阳性药组Treg细胞数量高于模型组，JAX2组Th17细胞数量与Th17/Treg显著低于模型组，阳性药组Th17/Treg明显低于模型组（见图3和图4）。
图3 小鼠Th17细胞（A）、Treg细胞（B）占CD4＋T淋巴细胞百分比（%）Fig 3 Percentage of Th17（A） and Treg （B）cells in mice CD4＋T lymphocytes（%）
图4 小鼠Th17细胞、Treg细胞比例及Th17/Treg的比值变化Fig 4 Changes in the proportion of Th17 and Treg cells and the ratio of Th17/Treg in each group of mice
2.4 Notch/STAT信号通路受体/配体蛋白的表达
小鼠肺组织染色后观察各组染色情况。与空白组相比，模型组小鼠肺组织内Delta1、Delta4显著升高，而Notch3、STAT3、P-STAT3及STAT6表达无显著差异；
与模型组相比，JAX2组小鼠肺组织内Delta1表达升高，Delta4显著降低，其中JAX2中剂量组治疗后，Notch3表达显著降低，而STAT3、P-STAT3、STAT6表达均无明显变化。上述结果提示，JAX2对于哮喘小鼠肺组织中STAT信号通路活性的调控作用弱于Notch通路，因此将进一步对Notch通路进行结果分析。结果见图5和6。
图5 免疫组化法测定各组受体/配体蛋白的表达（×200）Fig 5 Receptor/ligand protein expression of each group by immunohistochemistry（×200）
图6 各组小鼠肺组织受体/配体蛋白表达的比较Fig 6 Receptor/ligand protein expression in the lung tissue of each group
2.5 JAX2对小鼠BALF中IFN-γ、IL-4、IL-10和IL-17水平的影响
与空白组比较，模型组小鼠BALF中IL-4、IL-17水平显著升高，IFN-γ和IL-10水平显著下降。与模型组比较，JAX2治疗后小鼠BALF中IL-4和IL-17的表达水平明显降低，而IFN-γ和IL-10的表达明显升高。结果见表1。
表1 各组小鼠BALF中细胞因子的水平( ±s，n＝6)Tab 1 Content of cytokines in the BALF of mice ( ±s，n＝6)
表1 各组小鼠BALF中细胞因子的水平( ±s，n＝6)Tab 1 Content of cytokines in the BALF of mice ( ±s，n＝6)
注：与空白组比较，**P＜0.01，****P＜0.0001；
与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，####P＜0.0001。Note：Compared with the blank group，**P＜0.01，****P ＜0.0001；
compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001，####P＜0.0001.
－1－1－1组别IL-4/（pg·mL）IL-10/（ng·mL）IFN-γ/（pg·mL）IL-17/（pg·mL－1）空白组505.0±21.76 1.561±0.06631.3±21.80426.0±18.69模型组832.2±35.10****0.4719±0.04**445.2±29.07****888.8±41.28****JAX2高剂量组553.4±39.33### 1.239±0.03##613.0±21.96####593.9±35.03####JAX2中剂量组669.6±31.700.9767±0.04#588.8±13.29###633.4±15.65####JAX2低剂量组735.6±18.480.6110±0.02509.9±8.64#684.0±12.36###肺宁片组600.3±9.70##0.8165±0.02598.4±10.49###602.5±16.33####地塞米松组648.6±9.38 1.164±0.05##557.2±17.33###632.0±11.63####
2.6 Delta1、Delta4、Notch3蛋白与T细胞比例及各比值的相关性分析
小鼠肺组织内Delta1与Th1、Th2、Th17细胞水平成正相关，与Treg细胞水平、Th1/Th2、Th17/Treg不相关；
Delta4与Th1、Th2、Th17、Treg细胞水平、Th1/Th2、Th17/Treg均不相关；
Notch3与Th2、Th17细胞水平、Th17/Treg成负相关，与Treg细胞水平、Th1/Th2成正相关，与Th1细胞水平不相关。结果见表2。
表2 Delta1、Delta4、Notch3与T细胞比例和比值的相关性分析(r)Tab 2 Correlation analysis of Delta1，Delta4，Notch3 and T cell proportions (r)
哮喘是一种由淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等许多细胞参与的慢性气道炎症性疾病。本课题组前期研究证实JAX2可能通过抑制炎症因子产生和炎性介质的表达，促进Th1/Th2免疫平衡；
能通过抑制小鼠支气管壁增厚和hASMC的增殖和迁移，防止气道重塑[15]；
还能通过抑制MAPK/NF-κB炎症信号来预防哮喘的发生[16]。因此，鉴于免疫变态反应与气道炎症在哮喘中的密切关系，进一步深入研究T细胞、相关细胞因子以及信号通路间的相互作用，分析神香草对哮喘相关指标表达水平的影响，使得揭示神香草抗哮喘免疫炎症反应机制更具完整性。
近年来研究显示，Notch信号通路在许多疾病的T细胞免疫反应中发挥重要作用，更与哮喘的免疫失衡关系密切[17]。研究结果表明，通过上调Deltal蛋白的表达，抑制Jagged1、Notch1和NICD蛋白表达可缓解豚鼠的哮喘症状[18]。Notch能直接调控GATA-3水平，通过阻断Notch通路，降低GATA-3的表达[19]，抑制Th2细胞反应，从而改善哮喘气道炎症。实验证明Notch3在哮喘大鼠气道上皮细胞中呈高表达，下调Delta4-Notch信号后，能够减轻哮喘气道重塑和气道高反应性[20]。本研究结果显示，哮喘小鼠肺组织Delta1、Delta4表达水平与空白组相比明显增加，JAX2组治疗后，Delta1表达明显升高，Delta4明显降低，Notch3表达下降，说明三者均参与了哮喘的气道炎症反应，故推测Notch信号可能影响哮喘小鼠的炎症反应过程。同时，Th1/Th2细胞比值降低是气道炎症和高反应性形成过程中重要的起始和维持因素[21]，Th17/Treg免疫失衡也在哮喘的发病过程中发挥了重要作用[22]。本研究结果显
示JAX2能明显提高哮喘小鼠Th1、Treg细胞水平，升高Th1/Th2比值，且提高哮喘小鼠BALF中IFN-γ和IL-10表达水平；
Th2、Th17细胞水平及Th17/Treg均低于模型组，且哮喘小鼠BALF中IL-4和IL-17表达降低。JAX2干预哮喘小鼠后，Notch3表达降低与Th17/Treg降低、Th1/Th2增加相关，Delta1表达与Th1、Th2、Th17相关。因此推断JAX2对哮喘模型中的免疫失衡具有调节作用，其机制可能是通过抑制Notch通路中部分受体/配体蛋白的表达来发挥调节作用。
JAK/STAT通路是一条能够通过生长因子、细胞因子、干扰素和细胞因子信号转导抑制蛋白调节激活的保守通路，并且参与炎症过程[23]。有研究提出，JAK/STAT通路可能是哮喘潜在治疗方略的一个重点[24]。本研究结果表明，JAX2对STAT3、STAT6、P-STAT3蛋白的表达并无明显影响，提示JAX2不能通过下调STAT3、STAT6、P-STAT3蛋白的表达来改善哮喘免疫炎症反应。
综上所述，JAX2可通过调节Notch配体/受体蛋白表达改善哮喘免疫失衡的病理状态，这可能是其治疗哮喘的作用机制之一。但是，对调节该通路具体调节的炎症因子及靶点均不明确，尚需进一步深入研究。
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