于晓瑾，张萌，刘采艳，王硕，舒尊鹏，杨连荣（. 黑龙江中医药大学，哈尔滨 50040；
. 广东药科大学，广州 50006）
急性心肌缺血（acute myocardial ischemia，AMI）是由冠脉闭塞或血管痉挛而导致心肌缺血、缺氧或坏死的一种疾病[1]。有报道指出，我国心血管疾病的患病率持续上升，而心肌缺血仍是导致心血管疾病患者死亡的关键因素[2]。目前，其主要治疗手段为介入、药物和外科手术。中药因可以通过多靶点多途径发挥预防和改善心肌缺血损伤的作用而受到广泛关注[3]，在心血管系统保护和防治方面具有较好的疗效和应用前景。
刺玫果为蔷薇科蔷薇属植物山刺玫（Rosa davuricapall.）的果实，是一种药食同源的传统中药，其含有黄酮类、多酚类、多糖、鞣质、皂苷和维生素C等成分，具有抗氧化、抗炎、抗疲劳、抗衰老等作用[4]。研究还发现，其提取物能有效缓解心肌缺血症状[5]。生脉饮主要成分为党参、麦冬、五味子，用于气阴两亏，心悸气短，脉微自汗。临床研究表明，生脉饮可有效治疗心肌缺血等多种心血管疾病[6]。目前，对刺玫果的研究主要集中在黄酮、皂苷和多糖的提取、抗氧化等生物活性方面，但是未见刺玫果不同极性部位对急性心肌缺血保护作用的报道，刺玫果的抗急性心肌缺血活性成分也尚不清楚。
分子对接技术是一种中药的计算机辅助药物设计手段，可通过计算机编程建模功能模拟药物分子和受体之间的相互作用方式，并借助PDB、PubChem等数据库实现活性成分的虚拟筛选。目前，该技术操作简单，周期短，已经逐渐成为虚拟筛选中药活性组分的重要手段[7]。
因此，本研究通过建立小鼠急性心肌缺血模型，进一步观察刺玫果不同部位对心肌损伤小鼠的保护作用。同时，采用分子对接技术虚拟筛选刺玫果中抗心肌缺血的活性成分，以阐明中药具备多成分、多靶点、多途径的作用特点，为进一步探讨刺玫果对心肌缺血疾病的治疗提供参考。
1.1 动物
60只SPF级健康昆明小鼠，体质量（19±2）g，雌雄各半[黑龙江中医药大学实验动物中心，许可证号SCXK（黑）：2018-0004]。将小鼠喂养在通风良好，温度、湿度适宜的环境下，每日更换纯净水，喂标准的小鼠饲料，进行7 d适应性饲养。
1.2 试药
刺玫果采摘于黑龙江省大兴安岭，经黑龙江中医药大学中药资源与开发教研室王振月教授鉴定为正品。生脉饮（批号：200919，仲景宛西制药股份有限公司）。
盐酸异丙肾上腺素（ISO，批号：2124297，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
还原性谷胱甘肽（GSH）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）、α-羟丁酸脱氢酶（α-HBDH）、丙二醛（MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；
谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司）；
水合氯醛[批号：20210520，福晨（天津）化学试剂有限公司]。
1.3 仪器
BL-420F生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司）；
Synergy MX酶标仪（美国BIOTEK公司）。
2.1 提取物的制备
将刺玫果粉碎，过40目筛，以70%的乙醇为提取溶剂，料液比为1∶10，在80℃的水浴温度下回流提取3次，每次2 h，减压浓缩至稠膏后，加适量蒸馏水分散，依次用乙酸乙酯、正丁醇进行萃取分离，各萃取液与萃余液浓缩，60℃真空干燥箱，即得乙酸乙酯、正丁醇、水（萃余液浓缩）提取部分。灌胃时用蒸馏水制备混悬液。
2.2 分组、给药与造模
取60只心电图正常的小鼠，雌雄各半，随机分为6组，每组10只，分别为空白组、模型组、生脉饮组（4.5 mL·kg－1，阳性对照）、乙酸乙酯组（4.5 g·kg－1）、正丁醇组（4.5 g·kg－1）、水组（4.5 g·kg－1）。空白组与模型组给予等量的蒸馏水，其余各组均灌胃给药（ig），每日一次，连续15日。除空白组外，其余各组在第14、15日，在给药2 h后腹腔注射ISO（10 mg·kg－1），空白组腹腔注射等量氯化钠溶液。
2.3 小鼠的心电图检测
末次给药后，将各组小鼠以2.5%水合氯醛（10 mL·kg－1）腹腔注射麻醉[8-10]，仰位固定，将针状电极连接BL-420F生物机能实验系统，观察造模后1、5、10、15、20 min各组小鼠肢体Ⅲ导联心电图变化，记录各时间点的心率、ST段波幅。
2.4 小鼠血清中生化指标检测
在末次注射ISO 16 h后眼球取血，离心取血清，按试剂盒说明书检测各组小鼠血清中α-HBDH、CK、AST、LDH的活力。
2.5 小鼠心肌组织中生化指标检测
在小鼠眼球取血后，处死小鼠，取心脏，用生理盐水冲洗除去血污，剔除脂肪组织，滤纸吸干后称取适量，充分研磨，制得10%心肌组织匀浆，按试剂盒说明书检测各组小鼠心肌组织中T-SOD、CAT的活力和MDA、GSH的含量。
2.6 软件及数据库
AutoDockTools软件；
PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）；
PDB数据库（https：//www.rcsb.org）；
uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）；
CTD数据库（http：// ctdbase.org）。
2.7 配体的选择
根据相关文献可知[11-18]，刺玫果含有以下10种潜在活性成分，其中黄酮类7 个，三萜2 个，多酚类1 个，并在PubChem数据库中下载这些化合物的3D结构，详细信息见表1。
表1 刺玫果中 10 个化合物Tab 1 Ten compounds from Rosa davurica pall.
2.8 心肌缺血蛋白受体的选择
通过CTD数据库和相关文献搜集到与心肌缺血相关的6个靶点蛋白，分别为肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-1β（IL-1β）、抗凋亡蛋白（Bcl-2）、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（CASP3/Caspase-3）、转化生长因子β1（TGFB1），蛋白激酶B（AKT1）（见表2），在PDB数据库中优先选择具有原配体且分辨率好的人源受体晶体结构，下载三维结构。
表2 心肌缺血相关的靶点蛋白Tab 2 Target proteins associated with myocardial ischemia
2.9 分子对接
首先采用PyMOL软件除去蛋白分子的原配体与水分子，其次采用AutoDockTools进行配体与靶点蛋白的两两对接，获取结合能值，对接结果采用PyMOL软件进行可视化。同时，为了对接方法的可靠性与对接参数的合理性，计算原配体与对接构象的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD），通常认为RMSD在2 Å范围之内。
2.10 统计学分析
实验数据采用SPSS 26.0软件进行处理分析，结果以±s表示，所有数据均符合正态分布，方差齐时组间比较采用单因素方差分析和LSD两两比较，方差不齐时采用Tamhane’s T2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
3.1 刺玫果不同部位对小鼠心电图的影响
除空白组外，其余组小鼠注射ISO，模型组小鼠ST段明显下移（为急性心肌缺血造模成功标志[19]），见图1。由图2可知，与空白组相比，各组心率开始明显上升，其中，模型组心率于造模1～10 min显著上升。与模型组相比，给药后各组心率都有明显降低，其中，乙酸乙酯组、正丁醇组和水组于造模10 min 时心率显著降低（P＜0.01）。由图3可知，与空白组相比，各组ST段明显下移，其中模型组ST段在1～20 min内极显著下移（P＜0.01），提示造模成功。与模型组相比，给药组在1～20 min内均能显著抑制急性心肌缺血小鼠ST段的下移。
图1 刺玫果不同部位的心电图Fig 1 Electrocardiogram of different extracts of Rosa davurica pall.
图2 刺玫果不同部位对急性心肌缺血小鼠心率的影响Fig 2 Effect of different extracts of Rosa davurica pall. on the heart rate of mice with acute myocardial ischemia
图3 刺玫果不同部位对急性心肌缺血小鼠ST段的影响Fig 3 Effect of different extracts of Rosa davurica pall. on ST segment in mice with acute myocardial ischemia
3.2 刺玫果不同部位对小鼠血清中生化指标的影响
由图4可知，与空白组相比，模型组小鼠血清中α-HBDH、CK、AST和LDH水平均显著升高（P＜0.01）。与模型组相比，各给药组都能显著改善α-HBDH、CK、AST水平的异常情况，此外，乙酸乙酯组和正丁醇组还能明显降低LDH的水平。
图4 刺玫果不同提取部位对急性心肌缺血小鼠血清心肌酶的影响Fig 4 Effect of different extracts of Rosa davurica pall. on serum myocardial enzymes in mice with acute myocardial ischemia
3.3 刺玫果不同部位对小鼠心肌组织中生化指标的影响
由图5可知，与空白组相比，模型组小鼠心肌组织中T-SOD活力、GSH含量和CAT活力显著降低（P＜0.01），MDA含量明显提高（P＜0.01）。与模型组相比，乙酸乙酯组、正丁醇组和水组小鼠心肌组织中总SOD和CAT活力明显增强，MDA含量也明显减少，此外，乙酸乙酯组与正丁醇组心肌组织中GSH含量明显增多。
图5 刺玫果不同提取部位对急性心肌缺血小鼠心肌组织中抗氧化因子的影响Fig 5 Effect of different extracts of Rosa davurica pall. on antioxidant factors in myocardial tissue of mice with acute myocardial ischemia
3.4 分子对接实验结果
将6 个靶点蛋白的原有配体剔除，然后在对接到原活性位点上，计算原配体与对接后配体的RMSD，见表3，结果均小于2，说明所对接的分子构象能够较好地重现配体与蛋白的结合模式，对接参数设置合理。
表3 各靶点重新对接后与原靶点构象的 RMSDTab 3 RMSD of each target conformation after re-docking with the original target
应用AutoDockTools软件进行蛋白与药物分子的两两对接，对接结合能量见图6。其中，横坐标为相关靶点，纵坐标为刺玫果主要活性成分。颜色越深表示结合能越低，受体与配体结合得越好。结果显示，所有分子与靶点蛋白的最低结合能在－8.69～0.5 kcal·mol－1，当结合能小于0，表明受体与配体可以自发结合，与靶点蛋白之间均具有良好的结合活性。此外，基于个案排秩加法得到10 个成分对接综合得分，从大到小依次为齐墩果酸、熊果酸、木犀草素、槲皮素、原花青素B2、没食子酸、金丝桃苷、橙皮苷、银椴苷、芦丁。
图6 分子对接热图Fig 6 Molecular docking heat-map
为更清晰地了解化合物与蛋白的对接情况，选取6个结合自由能较低的结果进行可视化处理。由图7A可知，熊果酸与TNF中的氨基酸残基CYS69B、LYS112B形成氢键相互作用，与TRP114B、CYS69B形成疏水性相互作用；
由图7B可知，齐墩果酸与IL-1β中的氨基酸残基LYS165C形成氢键相互作用，与LYS153C形成疏水性相互作用；
由图7C可知，橙皮苷与Bcl-2中的氨基酸残基TYR16A、SER22A、TYR19A、GLN23A、ASP99A、ARG103A形成氢键相互作用，与LYS20A、SER102A形成疏水性相互作用；
由图7D可知，原花青素B2与CASP3中的氨基酸残基LYS260B、GLU248B、ASP990D、GLU246B形成氢键相互作用，与GLU246B、PHE247B形成疏水性相互作用；
由图7E可知，齐墩果酸与TGFB1中的氨基酸残基HIS289B形成氢键相互作用，与TYR288B、ARG56A、PRO334B、LEU335B、ILE354B形成疏水性相互作用；
由图7F可知，槲皮素与AKT1中的氨基酸残基THR450A、PHE150A、TYR152A、ILE447A形成氢键相互作用，与TYR152A形成疏水性相互作用。
图7 主要活性成分与靶点蛋白的分子对接模型Fig 7 Molecular docking model of the main active ingredients and target proteins
心肌中通常存在多种心肌酶，其中包括α-HBDH、CK、AST、LDH等，通常将这4种酶统称为心肌酶谱，可以间接反映心肌损伤程度。目前大量研究表明[20]，心肌缺血会导致抗氧化与氧化体系失衡，产生大量活性氧（ROS）物质，导致心肌氧化应激损伤，SOD、GSH、CAT是体内重要的抗氧化酶体系，可清除体内过多的氧自由基，而MDA是自由基攻击机体的产物，其含量反映机体过氧化的程度。因此，测量以上指标有助于评价抗心肌缺血药物的作用效果。本研究结果显示，各给药组均可降低血清中α-HBDH、CK、AST的活性、降低心肌组织中MDA的含量，升高心肌组织中总SOD和CAT活力，而乙酸乙酯组和正丁醇组小鼠血清中LDH的水平明显减少，心肌中GSH的活性升高，且乙酸乙酯组小鼠的大多生化指标与对照组无显著差异。因此对急性心肌缺血小鼠的保护作用从强到弱依次为乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位。
心肌缺血的发生机制比较复杂，与自由基损伤、钙离子超载、血管内皮细胞损伤和细胞凋亡等诸多因素有关[21]。有研究表明，Bcl-2、Caspase-3、TNF、IL-1β、TGFB1与AKT1蛋白都与心肌缺血都有着密切联系[22-25]。当药物进行预保护后，其有效成分与蛋白进行结合从而调控相关蛋白的表达，进一步减轻急性心肌缺血损伤。从分子对接综合结果来看，这10个成分均是抗急性心肌缺血活性成分，其中，齐墩果酸和熊果酸对接结果优良，两者为同分异构体，可以通过其抗氧化、抗炎、抗凋亡活性改善心肌损伤，这与文献报道符合[26-27]。
相关研究显示，刺玫果乙酸乙酯相、正丁醇相与水相相比，槲皮素、齐墩果酸、熊果酸、原花青素B2成分含量高[14]，推测这是刺玫果乙酸乙酯部位和正丁醇部位抗急性心肌缺血作用更好的原因之一；
而乙酸乙酯部位与正丁醇部位相比，其含有综合对接结果较佳的金丝桃苷，这也可能是乙酸乙酯部位对急性心肌缺血小鼠疗效强的原因之一。
综上所述，对ISO所诱导的小鼠急性心肌缺血损伤的影响中，刺玫果乙酸乙酯部位和正丁醇部位的保护作用优于水部位。同时，本实验利用分子对接技术筛选出刺玫果中抗急性心肌缺血活性成分，阐明刺玫果通过多成分-多靶点-多途径发挥保护作用。分子对接可以实现中药成分的快速筛选，节省时间。但该技术具有局限性，不能完全实现体内药物分子与受体蛋白结合的模型，因此，未来的研究方向会探究刺玫果防治急性心肌缺血的作用机制，以进一步验证分子对接结果。
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