张少杰, 唐凤珠, 王 瑢, 班莫璐, 黄兰诚, 周 凯, 林钻平, 瞿申红, 李东云
耳聋是耳鼻喉科一种常见的临床疾病,为人类残疾的重要原因。据第二次全国残疾人普查显示,全国各类残疾人的总数为8 296万,而听力残疾占总数的24.16%[1]。耳聋的影响因素可分为遗传和环境两个方面,而遗传性因素是最主要的,研究发现遗传缺陷引起的耳聋占比可达到60%[2]。线粒体基因12S rRNA、GJB2、GJB3、SLC26A4是我国遗传性耳聋重要的突变类型[3-5]。很多患者是在使用氨基糖苷类抗生素如庆大霉素、链霉素等药物后诱发耳聋。部分人对氨基糖苷类药物具有易感性,微小的剂量就可造成不可逆的听力损伤,甚至出现“一针致聋”现象。这种易感性通常是母系遗传的,其可能的发病机制与线粒体基因有关[6]。通常将这类耳聋称为氨基糖苷类抗生素性聋(aminoglycoside antibiotic-induced deafness,AAID)。广西作为少数民族较多的地区,壮族人口众多,还有瑶族、侗族以及仫佬族等其他少数民族。基因在长期进化过程中在不同种族、民族、地域间存在差异。本课题组前期研究发现广西壮族非综合征型耳聋的线粒体基因12S rRNA突变率仅为0.74%,明显低于我国其他地区和民族[7]。这除了与民族及区域的差异性相关外,是否还存在其他影响因素,比如是否存在很多同类家系因未发病而隐藏在正常的壮族人群中,值得进一步研究。氨基糖苷类药物因价格低廉、适用性广、使用方便而被广泛使用。因此,尽早筛出对氨基糖苷类抗生素致聋的易感者(尤其对于儿童)意义重大。为此,本研究通过对广西地区壮族听力正常人群的线粒体基因12S rRNA突变筛查,了解其突变率及突变特点,为早期诊断携带者及其家系成员提供合理的用药指导和遗传咨询,以有效避免高危人群出现药物性聋。
1.1一般资料 选取2017年6月至2021年12月在广西壮族自治区人民医院耳鼻咽喉头颈科门诊就诊或者住院的听力正常壮族患者150例。其中男95例,女55例,年龄3～60岁。受试者经病史采集、体格检查、听力学检查确定为听力正常(纯音测听检查双耳,0.25、0.5、1、2、4、8 kHz阈值均≤25 dB HL,鼓室压图为A型,声反射阈可引出)[8-9]。纳入标准:(1)受试者听力正常,并且父母双方三代均为广西人,在广西长期居住达20年以上;(2)按民族分类,父母双方三代均为壮族;(3)患者和家属同意参加本研究并签署知情同意书。排除标准:(1)各种类型耳聋(传导性聋、感音神经性聋)的患者;(2)外耳、中耳、内耳畸形的患者;(3)有与壮族以外其他民族联姻,或者与省外或国外种族联姻家族史者;(4)从外省迁移至广西居住时间未达20年者;(5)患者或家属不同意参加本研究。本研究经医院伦理委员会审查通过。
1.2方法
1.2.1 标本采集、DNA提取及处理 采用一次性负压EDTA抗凝采血管取受试者外周血5～10 ml,并进行编号。外周血裂解红细胞后采用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)从白细胞中提取基因组DNA,用超微核酸测定仪进行DNA浓度和纯度的定量检测。将提取到的DNA保存于-80 ℃超低温冰箱。
1.2.2 基因芯片检测 采用晶芯十五项遗传性耳聋基因检测试剂盒(微阵列芯片法,博奥生物集团有限公司,国械注准20173401343)及其配套仪器,检测样本线粒体基因12S rRNA的2个常见突变位点:1494C>T,1555A>G。
1.2.3 PCR扩增 取出试剂盒中PCR扩增试剂(扩增引物与扩增试剂混合物)A、B、C按20 μl/管,分装到3个PCR扩增管中,然后每管加入5 μl的样品基因组DNA,形成25 μl反应体系,并置于PCR扩增仪中,扩增程序见表1。
表1 PCR扩增程序
1.2.4 磁珠制备 将9 μl磁珠和30 μl结合缓冲液,置于磁力架上15 s,吸去液体后,再次加入30 μl结合缓冲液,涡旋混匀。
1.2.5 磁珠纯化 取20 μl PCR产物加入上述磁珠溶液,混匀后放置10 min,中间混匀1次。然后置于磁力架15 s,吸弃溶液。将0.1 M NaOH 120 μl加入试管充分混匀,静置10 min。再次放置磁力架吸附15 s,吸弃溶液,使用杂交缓冲液40 μl清洗一次并吸弃,然后加入杂交缓冲液20 μl配制成磁珠杂交溶液。
1.2.6 磁珠杂交 从上述磁珠杂交溶液中,取15.5 μl加到芯片的微阵列中,50 ℃杂交1 h。配制标准洗涤液Ⅰ(SSC终浓度为0.3×,SDS终浓度为0.1%)、洗涤液Ⅱ(SSC终浓度为0.06×),并使用洗干仪进行洗涤与干燥。
1.2.7 扫描检测及数据分析 将洗涤完并干燥好的芯片放入晶芯®LuxScanTM 10K/B微阵列芯片扫描仪中,使用配套的检测芯片判别系统进行信号的读取及结果判断,并进行数据分析。
1.3基因筛查及用药指导 对150例听力正常的壮族受试者进行耳聋突变基因筛查,为线粒体基因12S rRNA突变携带者提供科学用药指导。
150份样本中,检出线粒体基因12S rRNA 1555 A>G突变者1例(携带率为0.67%,见图1),并经Sanger测序证实为1555 A>G突变(见图2),未发现1494C>T位点突变。耳聋基因微阵列芯片检测结果见表2。
ⓐ野生型；
ⓑ12S rRNA 1555A>G突变
箭头所示为1555位碱基(A>G)
表2 耳聋基因微阵列芯片检测结果
3.11993年,Prezant等[10]在一个非综合征型母系遗传的阿拉伯-以色列耳聋家系中首次发现了线粒体基因12S rRNA A1555G突变,其临床特征表现为以高频下降为主的双侧感音神经性听力损失,从此揭开了1555A>G突变与氨基糖苷类药物性聋相关研究的序幕。线粒体基因全长16 569 bp,共有37个基因:编码13种多肽链、22种tRNA、2种rRNA(16S rRNA和12S rRNA)。在人类细胞中,12S rRNA由MT-RNR1基因编码,所以MT-RNR1即为mtDNA 12S rRNA,基因全长953 bp[11]。随后的研究发现线粒体基因12S rRNA 1555A>G突变后能够导致12S核糖体RNA亚基结构发生变化,这意味着它更接近细菌16S核糖体RNA亚基,容易与氨基糖苷类结合,这种亲和力的增加在内毛细胞中影响最为显著,可通过抑制核糖体蛋白质的合成,导致内毛细胞损伤和细胞毒性[12]。
3.2氨基糖苷类抗生素在多重耐药革兰阴性杆菌感染、脓毒血症、结核的治疗中具有显著效果,其安全性得到了临床认可,甚至在英国还被用作新生儿败血症的一线用药[13-14],在世界范围内也常用于治疗其他革兰阴性杆菌感染的疾病[15]。当然,在高剂量或长期治疗方案中,氨基糖苷类药物会引起肾毒性和耳毒性[16-17],后者可表现为前庭毒性或耳蜗毒性[18],并且目前仍无有效的治疗方法。线粒体基因12S rRNA突变的个体对氨基糖苷类抗生素有强易感性,可能存在使用单剂量或少剂量即可在极短的时间里诱发听力损失。但因忌惮氨基糖苷类抗生素致聋而在临床上统一采取慎用或禁用该药的做法是不可取的,因此利用基因微阵列芯片在特定的群体中高效筛出敏感个体,是一种有效可行的预防方法。特别是儿童,因其免疫系统发育不完善以及免疫力发展的不足,极易发生上呼吸道感染,并有可能累及邻近器官,如引发鼻窦炎、中耳炎、扁桃体炎[19],也可向下蔓延形成急性支气管炎或肺炎,在成长过程中患病就诊的次数越多,接触氨基糖苷类抗生素的风险就越高。在广西壮族聚居地,因家长缺乏专业卫生知识自购或者在私人诊所使用氨基糖苷类药物的概率大大增加。本研究筛出1例线粒体基因12S rRNA 1555A>G突变携带者,并通过对其母系家庭成员进行禁用氨基糖苷类药物健康宣传教育,能够起到前瞻性预防作用,从而避免今后药物性聋的发生。
3.3线粒体基因12S rRNA在不同地区的突变率不尽相同,湖南地区正常人群1555A>G携带率为0.11%[20]。李孟兰等[21]调查报道江苏地区人群1555A>G的突变携带率为0.31%,石家庄地区育龄妇女1555A>G突变携带率为0.31%[22]。肖颖等[23]通过对泰兴地区300例听力正常的孕妇进行1555A>G筛查,报告突变携带率为0.67%。本研究在150例壮族听力正常的人群中检测出1例线粒体基因12S rRNA突变患者,突变类型为1555A>G突变,检出率为0.67%,高于全国大部分地区,与泰兴地区报道的携带率相一致。我国线粒体基因12S rRNA突变主要以1555A>G为主,1494C>T突变概率较低[24]。本研究发现广西壮族人群中线粒体基因12S rRNA突变特点表现为1555A>G,较1494C>T突变发生率高,这与全国大部分地区报道相符。广西地区壮族正常听力人群中1555A>G携带率相对较高,分析其原因,可能与以下因素相关:(1)广西壮族群体中,特别是一些分支,如黑衣壮、蓝衣壮,因言语和生活环境的特殊性,这些群体在一定的时间内保持着民族内通婚,遗传信息的保守性较好,这可能是耳聋基因突变位点携带率民族间差异性所在[25]。(2)本研究的150例进行药物性耳聋基因筛查的受试者对耳聋基因筛查这项技术的了解均为首次,说明壮族人群中基层专业卫生人员的相关培训与耳聋基因筛查的卫生宣传不足,很多耳聋基因突变的携带者还隐藏在听力正常的人群中,因为没有发病而没有被区分出,这与广西某些地区经济相对落后、医疗相关筛查知识普及率低有关。因此,通过相应的培训提高基层医院医务工作者对基因筛查的重要认知,传播耳聋基因筛查相关知识是非常必要的。
综上所述,广西听力正常的壮族人群中存在线粒体基因12S rRNA 1555A>G突变,对广西壮族人群进行线粒体基因12S rRNA筛查具有重要意义,一方面可以尽早筛出对氨基糖苷类抗生素致聋的易感者,降低药物性聋的发生;另一方面,根据线粒体的母系遗传规律,对其母系家庭成员进行基因确认,对未发病的家庭成员进行禁用氨基糖苷类抗生素的宣教,是一种有效的防聋举措。但本研究样本量偏小,具有一定局限性,且仅研究了壮族群体,对于广西地区其他民族听力正常人群线粒体基因12S rRNA突变的特点及其差异性,还应在后期的工作中扩大样本量进一步研究。
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