宋国阳，李斐然，王富江，汪 斌，葛海涛*
（1.南京中医药大学 药学院，江苏 南京 210023；
2.江苏苏中药业研究院有限公司 中药室，江苏 南京 210009；
3.南京中医药大学附属医院 临床药理科，江苏 南京210029）
痔疮（Hemorrhoids，HRD）是一种肛肠科疾病，多伴有为疼痛、出血、直肠脱垂等病理表现[1]。临床上将内痔分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四阶段，当痔疮处于早期阶段时，通常采用非手术治疗手段如外用药物减轻症状[2-3]。
痔瘘熏洗剂（ZLX）为江苏省中医院治疗痔疮肿痛的院内制剂，由大黄、虎杖、五倍子、荔枝草、鱼腥草所组成，具有清热止痛、燥湿敛疮的功效。临床研究表明痔瘘熏洗剂能够减轻炎症、消除水肿并促进创面愈合[4-6]。然而痔瘘熏洗剂研究仅局限于临床疗效观察，还未深入研究其发挥药效的作用机制。
本研究运用网络药理学筛选出痔瘘熏洗剂治疗痔疮的核心成分、作用靶点和相关通路，并采用分子对接进行验证，接着构建痔疮动物模型评价痔瘘熏洗剂治疗痔疮的药理作用并初步验证治疗分子机制。
1.1 药物及试剂
痔瘘熏洗剂（批号：2106020，江苏省中医院）；
金玄痔科熏洗散（批号：210507，马应龙药业集团股份有限公司）；
巴豆油（批号：Z01A10H84659，上海源叶生物科技有限公司）；
乙醚（批号：210315636D）、吡啶（批号：10030210242），均购自南京化学试剂股份有限公司；
水合氯醛（批号：B1826028，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；
大鼠TNF-α 抗体（批号：ab109322）、大鼠MMP9 抗体（批号：ab283575），均购自Abcam 公司。
1.2 动物
SPF 级SD 大鼠40 只，雌雄各半，体质量为（200±10）g，大鼠购自南通大学［许可证号：SCXK（苏）2019-0001］。动物在温度（25±1）°C、相对湿度（50±5）%的标准实验条件下，饲养于江苏苏中生物制药有限公司动物房［许可证号：SYXK（苏）2017-0059］，适应性饲养3 d。动物实验通过江苏苏中生物制药有限公司动物伦理委员会审核批准（SZSW-2022041503）。
1.3 主要仪器
RM2016 型病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；
ST5010 型全自动染色机(德国LEICA 公司)；
JJ-12J 型脱水机（武汉俊杰电子有限公司）。
1.4 痔瘘熏洗剂活性成分及靶点收集
基于经皮给药系统（TTDs）药物特点，采用TCMSP 数据库（http://tcmspw.com/），结合文献报道以DL ≥0.18、AlgP ＞5、分子 量≤500 为筛选条件，收集大黄、虎杖、五倍子、鱼腥草、荔枝草五味药材的化学成分。将筛选出的成分导入Swiss Target Prediction 数据库（http://swisstargetprediction.ch/），以score ＞0 为筛选条件，获得药物相关靶点。
1.5 疾病靶点及交集靶点收集
以“hemorrhoids”为 关 键 词，检 索OMIM、GeneCards、TTD 数据库收集疾病相关靶点，以score ＞0 为阈值，收集三种疾病数据库交集靶点，通过Venny 工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）收集痔瘘熏洗剂与痔疮的交集靶点。
1.6 PPI 网络构建及分析
将交集靶点导入STRING 数据库（https://stringdb.org/），设定物种为Homo sapiens，最小置信度＞0.4，PPI 网 络 以TSV 格 式 导 入Cytoscape 软 件，设置阈值为degree 二倍中位数、BC（Betweenness Centrality）中位数和CC（Closeness Centrality）中位数，收集满足上述参数的核心靶点。
1.7 “成分-潜在靶点”网络构建
将筛选出的活性成分、潜在靶点导入Cytoscape软件，构建“成分-潜在靶点”网络。设置阈值为degree 二倍中位数、BC 中位数和CC 中位数，筛选满足上述参数的核心成分。
1.8 KEGG 通路富集分析与GO 富集分析
将潜在靶点导入Metascape 数据库（https://metascape.org/），以P＜0.05 为条件，进行KEGG 富集通路分析及GO 富集分析，获得痔瘘熏洗剂治疗痔疮相关通路与生物过程、细胞组分、分子功能，并利用微生信网站对结果可视化分析。
1.9 “成分-靶点-通路”网络构建
将核心成分、核心靶点和相关通路导入Cytoscape 软件构建“成分-靶点-通路”网络，预测出痔瘘熏洗剂发挥治疗作用的作用机制。
1.10 分子对接
在PDB 数据库（https://www1.rcsb.org/）中下载靶点蛋白的3D 结构，利用Chimera 去除蛋白原有配体，并用Pymol 与Autodock 对蛋白去水加氢，对主要活性成分加氢、电荷、质子化确认，利用AutoDock Vina 进行分子对接。
1.11 造模及分组
大鼠适应性喂养3 d 后，随机分为空白组、模型组、金玄痔科熏洗散组、痔瘘熏洗剂组，每组各10 只，雌雄各半。参考文献[7]方法建立巴豆油大鼠肛周肿胀模型，取蒸馏水、吡啶、乙醚和6%巴豆油溶液按照 1 ∶4 ∶5 ∶10 比例混合，配制造模剂。大鼠注射0.1 mL10%水合氯醛麻醉，取吸入0.10 mL 造模剂的棉签置入大鼠肛门直肠2 cm 处，维持时间10 s，造模后7 h 观察大鼠肛周组织是否出现充血、水肿，用以评价造模是否成功。
1.12 给药及取材
模型组给予生理盐水浸泡肛周部位10 min，给药组基于大鼠与人临床给药剂量换算为6.3 ∶1，痔瘘熏洗剂组每日给药量为18 mL/kg（相当于生药量8.64 g/kg），金玄痔科熏洗散组每日给药量为9.9 g/kg，1 次/d。造模成功大鼠在造模后7、24、48 h 给药。在末次给药后1 h 处死大鼠，沿肛周分离肛门，剪出2 cm 直肠，固定于10%多聚甲醛中。
1.13 痔瘘熏洗剂对大鼠肛周肿胀的影响
各给药组于造模后7、24、48 h 将药物浸泡于肛门肿胀处10 min, 每次给药0.5 h 后, 用游标卡尺测量大鼠肛周上下、左右两直径，取均值，计算肛周肿胀面积。
1.14 HE 染色观察大鼠直肠病理学变化
末次给药1 h 后处死, 取2 cm 直肠组织, 10%多聚甲醛固定, 做病理组织学检查,观察分析各组大鼠直肠病理组织形态变化。
1.15 免疫组化法检测直肠中TNF-α、MMP9 蛋白的表达情况
切片脱蜡后修复,随后阻断封闭,加一抗孵育过夜,加二抗孵育 1 h，PBS 冲洗三次后DAB 显色，苏木素复染,脱水封片，在显微镜下观察并拍片。每张照片取四个不重叠视角，使用Image-Pro Plus 计算平均光密度（IOD/ AREA）比值并平行计算三次，分析直肠组织中TNF-α、MMP9 蛋白的表达情况。
1.16 统计学方法
用GraphPad Prism 软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差（±s）表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 痔瘘熏洗剂活性成分及靶点收集
筛选出32 种活性成分结果见表1。其中，大黄9个，虎杖11 个，荔枝草6 个，鱼腥草9 个，五倍子2 个。通过Swiss Target Prediction 平台筛选相关靶点，获得药物靶点510 个。
表1 痔瘘熏洗剂潜在活性成分Tab.1 Potential active ingredients of Zhilou Lotion
2.2 疾病靶点及潜在作用靶点获取
基于OMIM、GeneCards、TTD 数据库共收集492个疾病靶点。将510 个药物靶点与492 个疾病靶点导入Venny 作图网站，得到77 个交集靶点并绘制Venny 图，见图1。这77 个交集靶点作为痔瘘熏洗剂治疗痔疮的重要靶点。
图1 痔瘘熏洗剂与痔疮交集靶点韦恩图Fig.1 Venn diagram of the intersection target of Zhilou Lotion and hemorrhoids
2.3 PPI 网络构建及分析
将77 个潜在靶点导入 STRING 数据库构建PPI网络，见图2。该网络共有67 个节点与664 条边，degree 值表示节点与节点之间的关联程度，degree值越大说明在这个网络中越重要，以degree ≥12、BC ≥0.006、CC ≥0.413 为筛选条件，筛选出23 个核心靶点。
图2 PPI 网络核心靶点筛选流程Fig.2 Screening process of core targets of PPI network
2.4 “成分-潜在靶点”网络的构建
将32 种活性成分与23 个潜在靶点导入Cytoscape 构建“成分-潜在靶点”网络，见图3。以degree ≥8、BC ≥0.005、CC ≥0.385 为筛选条件，筛选出7 个核心成分见表2，推测这7 种成分可能是痔瘘熏洗剂治疗痔疮的核心成分。
图3 “成分-潜在靶点”网络Fig.3 “Component-potential target”network
表2 核心成分参数筛选表Tab.2 Screening table of core ingredient parameters
2.5 KEGG 通路富集分析与GO 富集分析
将21 个核心靶点导入Metascape 数据库，富集到92 条通路。以基因数≥6 为筛选条件共收集出5条与痔疮相关的通路，包括PI3K-Akt 通路、TNF 通路、IL-17 通路、HIF-1 通路、MAPK 通路，这5 条通路可能作为痔瘘熏洗剂治疗痔疮的重要通路，选取基因数排名前20 的条目展示见图4。GO 富集分析到607 条生物过程涉及MAPK 级联正向调节、血管生成调节、炎症反应、对脂多糖的反应等；
富集到20 个细胞组分涉及膜筏、细胞外基质、转录调节复合体、囊泡腔；
富集到33 种分子功能涉及细胞因子受体结合、转录因子结合、激酶结合、金属内肽酶活性等。各选取P值前10 条目展示见图5。
图4 痔瘘熏洗剂治疗痔疮排名前20 KEGG 通路Fig.4 Top 20 KEGG pathway of Zhilou Lotion in the treatment of hemorrhoids
图5 痔瘘熏洗剂治疗痔疮靶点GO 富集分析结果Fig.5 GO function enrichment analysis of hemorrhoids target treated with Zhilou Lotion
2.6 “成分-靶点-通路”网络构建
结果分析可知痔瘘熏洗剂通过大黄酚、大黄素甲醚、没食子酸、甲基正壬酮、高车前素、大黄酸、白藜芦醇等核心成分，作用于TNF、IL-6、IL-1β、MMP9、VEGFA 等核心靶点，介导PI3K-Akt、TNF、IL-17、HIF-1、MAPK 相关信号通路中发挥治疗作用，见图6。
图6 “成分-靶点-通路”网络Fig.6 ＂Component-target-pathway＂ network
2.7 分子对接分析
选择degree 值较高的白藜芦醇、大黄酚、高车前素、甲基正壬酮、没食子酸与VEGFA、TNF-α、MMP9、IL-6 进行分子对接。对接结果显示5 种核心成分与 4 个核心靶点结合能均低于-5 kJ/mol，结果见表3。其中大黄酚与VEGFA、TNF-α、IL-6 等蛋白及白藜芦醇与MMP9 蛋白具有较好结合能力，对接模式见图7。
表3 核心成分与核心靶点结合能表（kJ/mol）Tab.3 Binding energy table of core component and core target （kJ/mol）
2.8 痔瘘熏洗剂对大鼠肛周肿胀的影响
与空白组比较，模型组大鼠肛周肿胀面积明显增加（P＜ 0.01），显示造模成功。痔瘘熏洗剂组与金玄痔科熏洗散组大鼠较模型组大鼠肿胀面积均明显减少（P＜ 0.01），金玄痔科熏洗散组与痔瘘熏洗剂组相比，大鼠肿胀面积差异无统计学意义（P＞0.05），见表4。结果表明痔瘘熏洗剂与金玄痔科熏洗散均可改善巴豆油引起的大鼠肛周肿胀。
表4 痔瘘熏洗剂对大鼠肛周肿胀面积的影响（±s，n = 8）Tab.4 Effect of Zhilou Lotion on perianal swelling in rats（±s，n = 8）
表4 痔瘘熏洗剂对大鼠肛周肿胀面积的影响（±s，n = 8）Tab.4 Effect of Zhilou Lotion on perianal swelling in rats（±s，n = 8）
注：模型组与空白组比较，**P ＜0.01；
给药组与模型组比较，##P ＜0.01。
组别 7.5 h 24.5 h 48.5 h空白组 1.41±0.10 1.41±0.10 1.41±0.10模型组 2.41±0.28** 2.83±0.24** 2.55±0.24**痔瘘熏洗剂组 1.78±0.17## 1.55±0.15## 1.46±0.11##金玄痔科熏洗散组 1.74±0.15## 1.56±0.17## 1.44±0.16##F 38.980 119.900 93.720 P 0.000 0.000 0.000
2.9 HE 染色观察大鼠直肠病理学变化
空白组直肠组织结构完整，黏膜下层未见充血、水肿等病变，见图8A。模型组腺体大量缺失，炎性细胞浸润，黏膜下层发生充血并伴有轻微水肿，见图8B。与模型组比较，痔瘘熏洗剂组与金玄痔科熏洗散组。腺体排列均相对完整，水肿、充血等病理性改变也相对减轻但仍有少量炎性细胞浸润现象，见图8C、8D。
图8 各组大鼠直肠组织病理情况（HE 染色，100×）Fig.8 Rectal tissue pathology in rats（HE staining，100×）
2.10 免疫组化法检测直肠中TNF-α、MMP9 蛋白的表达情况
与空白组比较、模型组大鼠直肠组织 TNF-α、MMP9 蛋白表达明显上调（P＜0.05，P＜0.01）；
与模型组比较,痔瘘熏洗剂组大鼠直肠组织TNF-α、MMP9 蛋白表达显著（P＜0.05），结果见图9。
图9 痔瘘熏洗剂对大鼠直肠组织TNF-α、MMP9 蛋白表达的影响（免疫组化，200×）Fig.9 Expression of TNF-α、MMP9 in the rectal tissue of mice in each group（Immunohistochemistry，200×）
痔疮发病发病时巨噬细胞分泌IL-6、IL-1β、TNF-α 引发炎症反应作用于血管壁、细胞外基质等，从而使肛垫出现静脉扩张、新血管形成、弹性纤维的退变性变化[8]。
本研究筛选出7 种核心成分即大黄酚、大黄酸、白藜芦醇、没食子酸、高车前素等。大黄酚促使NF-κB失活，下调TNF-α、IL-1β 表达，进而减轻炎症反应[9]。当炎症发生时，常伴有疼痛产生，白藜芦醇抑制PGE2 表达,缓解炎性痛[10]。没食子酸对蛋白质有沉淀作用，凝固溃疡面组织蛋白，加速创面愈合[11]。VEGFR2 参与血管生成多个关键步骤。高车前素通过靶向 VEGFR2 介导的PI3K/Akt/mTOR 信号通路抑制血管生成[12]。
痔疮病变过程中主要涉及三类细胞因子即炎症因子、生长因子、间质因子[13]。TNF-α 刺激血管内皮细胞受损，致使血管通透性增加，从而导致痔组织出现炎性水肿症状[14]。血管新生是痔疮发病机制之一，活化的VEGF 与VEGFR-2 结合后诱导Akt 磷酸化，加速血管新生[15]。洪艺云等[16]发现MMP9 与VEGF 相互协同促进血管通透性增加。MMP9 表达水平与内痔的严重程度、病程的发展具有相关性[17]。
通过KEGG 分析筛选出五条治疗相关通路：HIF-1 信号通路、IL-17 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路、TNF 信号通路。当痔疮发病时炎症因子分泌增加导致机体耗氧量增多从而形成低氧环境，低氧环境诱导 HIF-1a 过度表达，激活下游VEGFA 蛋白表达，VEGFA 又与VEGFAR2 结合介导下游的PI3K/Akt 和 MAPK 等信号通路从而参与血管生成过程[18-19]。IL-17 信号刺激下游NF-κB 活化，进一步分泌IL-6、TNF-α 与促进基质金属蛋白酶的合成，从而引起炎性细胞浸润和组织结构破坏[20]。分子对接结果表明核心成分与核心靶点能够自主结合。
巴豆油应用会导致大量炎症细胞迁移，并释放前列腺素、白三烯、缓激肽等炎症脂质代谢物而从而引起炎症反应[21]。痔瘘熏洗剂对巴豆油所致肛周肿胀具有治疗作用，结合大鼠直肠组织病理结果，证实痔瘘熏洗剂能够减轻巴豆油诱导大鼠模型的水肿、出血症状。针对与痔疮发病密切相关的细胞因子（TNF-α、MMP9）进行验证,结果显示痔瘘熏洗剂能够明显下调TNF-α、MMP9 表达，且与其发挥抗炎机制有关。
本研究观察痔瘘熏洗剂对大鼠肛周肿胀模型的作用，结果表明痔瘘熏洗剂治疗作用与下调TNF-α、MMP9 的表达从而发挥抗炎、消肿作用有关。研究不足之处在于本研究选用的巴豆油诱导大鼠肛周肿胀模型为经典近似痔疮模型。此外，筛选出的化学成分仅考虑成分活性，未考虑实际给药后的入血情况。后续将建立多种抗炎、镇痛模型综合评估痔瘘熏洗剂抗炎、镇痛作用，并深入研究治疗过程中起到调控作用的作用机制。
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