李盼盼 李俊杰 朱妍 龚烨珣 李晶晶 宋愈
糖尿病是以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病，目前我国糖尿病患病率已上升至11.2%[1]。随着糖尿病病程的延长，患者全身疾病的发病率及严重程度将逐渐增加。有研究表明，超过50%的糖尿病患者伴有角膜异常[2]。角膜是主要的屈光介质，角膜的透明性是维持正常视功能的前提。长期高血糖会引起角膜内部生理结构均发生变化，如角膜上皮钙沉积、上皮基底细胞变性和糖原颗粒增加，基质层细胞密度的降低和胶原蛋白束的异常，从而导致角膜透明度降低和光散射增加[3-5]。Pentacam AXL系统是一种基于Scheimpflug原理的眼前段分析仪，利用光的散射原理进行光密度分析，来测量角膜不同层次、不同直径区域角膜光密度(Corneal densitometry，CD)。CD值用灰度值0～100表示，0为完全透明，100为完全混浊[4]。Pentacam AXL系统能够系统、量化评价角膜的透明性，即使在裂隙灯显微镜下未发现明显病变的角膜中也可能检测出CD值增加[6-7]。CD值的测量可能提供关于角膜微结构变化的进一步信息，并可能为慢性高血糖引起的角膜病变的机制提供新的见解[8]。本研究分析2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者CD的特征，并进一步分析T2DM患者角膜各层、各区域CD值与年龄、糖尿病病程及血糖不同时期控制水平的相关性。
1.1 对象
纳入标准：①T2DM患者符合中国2 型糖尿病防治指南（2020 年版）诊断标准[1]；
②顺利完成Pentacam AXL三维眼前节分析诊断系统检查。排除标准：①合并急慢性感染、严重肝肾疾病、恶性肿瘤、免疫系统疾病或血液系统疾病；
②患角膜溃疡、角膜瘢痕、圆锥角膜等角膜病；
③患翼状胬肉、葡萄膜炎、青光眼等眼部疾病；
④眼部外伤史、眼部手术史者。
连续纳入2021年12月至2022年2月于南通市第一人民医院就诊的T2DM患者为T2DM组；
并选择此时间段内与之年龄相匹配的门诊体检健康人群为对照组。T2DM组共纳入125例（125眼），其中男67 例，女58 例；
对照组共纳入126 例（126 眼），其中男66例，女60例。本研究遵循赫尔辛基宣言，经南通市第一人民医院医学伦理委员会批准（批号：2021KT117），所有研究对象均签署知情同意书。
1.2 检查方法
1.2.1 常规检查 所有纳入对象均采用裂隙灯显微镜（IEC601-1，日本Topcon公司）检查眼前节，排除眼表疾病。采用非接触式眼压计（CT-1，日本Topcon公司）测量眼压，连续测量 3次，记录其平均值。采用角膜内皮显微镜（SP-2000P，日本Topcon公司）检查角膜内皮，连续测量 3次，记录其平均值。所有受检者测量身高、体质量，并计算体质量指数（Body mass index，BMI）。
1.2.2 Pentacam AXL检查 所有Pentacam AXL三维眼前节分析诊断系统（AXL，德国Oculus公司）检查均由同一熟练技师在暗室环境中完成。患者瞳孔在自然状态下，下颌置于下颌托，额头固定于头架，瞬目数次以保证泪膜分布均匀，测量时睁大双眼注视前方Pentacam旋转轴中心。操作者瞄准和对焦后自动采集图像，获取成像质量最佳的图像进行数据采集，记录角膜表层（距角膜上皮120 µm，包括角膜上皮层和浅层基质）、中层、内层（距角膜内皮60 µm，包括角膜内皮层和深层基质）以及角膜全层分别以角膜顶点为中心0～2、＞2～6、＞6～10、＞10～12 mm及0～12 mm直径区域CD的平均值。记录眼轴长度（Axial length，AL），角膜体积（Corneal volume，CV），角膜白到白（White to white，WTW），前房深度（Anterior chamber depth，ACD），中央角膜厚度（CCT），角膜顶点处的角膜厚度（Corneal thickness，CT）以及2、6、8、10 mm直径圆环上CT的平均值。
1.2.3 HbA1c、GA测量 所有T2DM患者空腹8 h，于次日晨抽取肘静脉血4 mL，分离血清，当日送检，检查糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin，HbA1c）、糖化白蛋白（Glycated albumin，GA），并计算GA/HbA1c。
1.3 统计学方法
病例对照研究。采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。本研究只纳入右眼数据进行分析。计量资料经Kolmogorov-Smirnov检验后符合正态分布，以表示，组间差异比较采用独立样本t检验；
不符合正态分布数据，以M（Q1，Q3）表示，组间差异比较采用Wilcoxon检验。计数资料比较采用卡方检验。采用Spearman秩相关分析角膜不同层次不同范围的CD值与T2DM患者的糖尿病病程、HbA1c、GA的相关性；
采用Pearson线性相关分析角膜不同层次不同范围的CD值与年龄、GA/HbA1 的相关性。用偏相关系数控制相关因素后，进一步分析T2DM患者CD与糖尿病病程和HbA1c的相关性。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 对照组和T2DM组受检者基本资料
T2DM组的BMI高于对照组，差异有统计学意义（Z=-6.90，P＜0.001）。2组受检者的年龄、眼压、AL、CCT、WTW、CV、ACD和角膜内皮细胞密度（Endothelium corneal density，ECD）差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表1。T2DM组患者的DM病程为5（1，10）年，BMI为26.4（24.4，27.8）kg/m2，HbA1c为8.5（7.6，10.1）%，GA为19.60（14.75，24.05）%，GA/HbA1c为2.20±0.58。
表1.对照组和T2DM组受检者基本资料比较Table 1.Comparison of basic data between control group and T2DM group
2.2 对照组和T2DM组受检者不同直径圆环上CT比较
T2DM组角膜中心及角膜直径2、6、8、10 mm圆环上CT略高于对照组，但差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。
表2.对照组和T2DM组受检者不同直径圆环CT (µm)比较Table 2.Comparison of CT (µm) of different diameter circles between control group and T2DM group
2.3 对照组和T2DM组受检者不同层次、不同直径区域CD值比较
T2DM组角膜表层、中层、全层各直径区域CD值以及角膜内层0～2、＞2～6、＞10～12、0～12 mm直径区域CD值均明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；
角膜内层6～10 mm直径区域的CD值与对照组相比，差异无统计学意义（t=-1.79，P=0.078）。见表3。
表3.对照组和T2DM组受检者角膜不同层次、不同直径区域CD值比较Table 3.Comparison of CD at different levels and different diameters on different corneal layer between control group and T2DM group
2.4 对照组和T2DM组受检者的年龄与CD值的相关关系
对照组的年龄与角膜表层、中层、内层及全层0～2、＞2～6、＞10～12、0～12 mm直径区域CD值均呈正相关（r=0.25～0.62，均P＜0.05)；
T2DM组患者的年龄与角膜表层、中层、内层及全层0～2、＞2～6、＞10～12、0～12 mm直径区域CD值均呈正相关（r=0.18～0.62，均P＜0.05）。
2.5 T2DM患者糖尿病病程及不同时期血糖控制水平与CD值的相关关系
用偏相关系数控制年龄、HbA1c 因素后，T2DM组患者的糖尿病病程与角膜中层0～2 mm直径区域CD值呈正相关（r=0.23，P=0.021）；
与角膜内层6～10 mm、全层6～10 mm直径区域CD均呈负相关（r=-0.25，P=0.005；
r=-0.19，P=0.037）。T2DM组患者的糖尿病病程与角膜其他层次、其他直径区域CD值均无相关性（均P＞0.05）。
用偏相关系数控制年龄、糖尿病病程因素后，T2DM组患者的HbA1c与角膜中层＞2～6 mm直径区域CD值呈正相关（r=0.19，P=0.030)；
与角膜其他层次直径区域CD值均无相关性（均P＞0.05）。GA、GA/HbA1c与角膜各层次、各直径区域CD值均无相关性（均P＞0.05）。
正常的角膜不吸收可见光，对光的散射较小[9]，当角膜发生自身病变（如角膜浸润、感染性角膜炎、圆锥角膜等）或受其他系统性疾病（如类风湿性关节炎、糖尿病等）影响时，角膜内部生理结构均会发生变化，从而导致透明度降低和光后向散射增加，可表现为CD值增加[6-7]。在本研究中，我们使用Pentacam AXL测量分析T2DM患者角膜各层、各直径区域的CD值，并进一步分析T2DM患者各层、各直径区域CD值与年龄、糖尿病病程及不同时期血糖控制参数的相关性，以探讨反映糖尿病患者早期角膜病变的敏感指标。
本研究发现对照组和T2DM组角膜同一层次中CD值从中央到周边均逐渐增加；
而同一区域，CD值从表层到内层逐渐减小，这与既往研究[8,10]一致。CD值与角膜胶原纤维分布的密度和胶原纤维直径的大小有关，角膜胶原纤维直径越小，纤维小板排列越精密，CD值越小。既往研究发现人类角膜中心有200～250个纤维小板，从角膜基质浅层到深层胶原纤维直径逐渐减小，纤维小板的堆积密度增加；
从角膜中央到周边，角膜厚度增加，角膜周边基质中的胶原蛋白增加，胶原纤维直径逐渐增加，胶原纤维间距离增加[10-11]。Özyol等[10]研究发现，糖尿病患者角膜直径0～10 mm区域内前层和0～2 mm区域内全层的光后向散射明显高于正常对照组；
Calvo-Maroto等[12]研究也发现，糖尿病患者在角膜中央直径3 mm和5 mm区域的光后向散射均明显高于正常人；
在Gao等[4]研究中，与正常人群相比，糖尿病患者各层次各区域内CD值明显增加，这与本研究结果一致。我们分析其原因可能是因为高糖环境下糖基化终末产物在角膜上皮基底膜、基质、后弹力层处异常累积[13]，从而导致CD值增加。此外，长期高血糖导致角膜胶原纤维的变性也可能增加CD值。糖尿病患者角膜中央区域的光后向散射发生明显变化，CD值的变化可以作为评估角膜病理生理超微结构变化的反应指标，从而作为一种监测和评估糖尿病角膜病变的有效手段[4,11]。
在Gao等[4]研究中，与正常人群相比，糖尿病患者CCT增加，ECD降低（均P＜0.05）。但本研究中2组患者CCT和ECD差异无统计学意义。Kim等[14]研究结果表明糖尿病患者的病程越长，对CV、ECD和CCT的影响越大。我们分析可能是因为在Gao等[4]研究中糖尿病患者的病程（平均9.02年）比本研究中T2DM患者的病程长。本研究中，T2DM患者CV、CCT增加，ECD降低，且差异均无统计学意义，由此认为在T2DM患者中，CD可能先于CT和ECD发生改变。
本研究发现2组患者不同层次、不同直径区域内CD值与受检者年龄均呈正相关，既往有研究发现角膜胶原纤维随着年龄增长发生糖基化作用，角膜胶原纤维变粗、变硬，且越接近巩膜，这种作用产生的效应越大[15]。在Gao等[4]研究中用偏相关系数控制年龄因素后，角膜中层和内层0～2 mm的CD值与DM病程呈正相关（r=0.29、0.35，P＜0.001），这与本研究一致，但Gao等[4]的研究中仅分析角膜中央0～2 mm区域不同层次CD值与DM病程的相关性，未进一步分析其他直径区域的CD值与DM病程的相关性。本研究T2DM病程与角膜中层和全层＞6～10 mm直径区域的CD均呈负相关（均P＜0.05），考虑一是因为周边区的CD值测量会受到角膜直径大小和睫毛、眼睑遮挡等原因的影响，周边区的CD值尤其是＞10～12 mm区域的重复性较差，可靠性较低[16]；
二是因为角膜周边区CD值易受血脂水平的影响，如Yilmaz等[17]研究发现角膜周边区的CD值与血清甘油三酯水平之间呈正相关（r=0.33，P=0.03），但本研究未统计分析T2DM患者血脂的情况，不能排除血脂对CD值的影响。
HbA1c是红细胞中的血红蛋白与血液中糖类相结合的产物，半衰期为90～120 d，不受每天血糖波动的影响，也不受运动或食物等外部环境短时间变化的影响，能够有效地反映糖尿病患者过去3个月左右血糖的控制情况，是监测长期血糖控制状况的指标[18]。GA是血液中的葡萄糖与血清蛋白的糖基化产物，半衰期为12～21 d，可以监测近2～3周血糖波动水平，是中期血糖控制状况的指标[9]。GA/HbA1c的半衰期为9 d，能够反映比GA周期更短的血糖波动情况，是监测糖尿病患者短期血糖控制状况的新型指标[18]。本研究采用偏相关系数控制年龄和病程因素后进一步分析患者长期、中期及短期血糖控制水平与角膜不同层次，不同区域CD值的相关性，发现中期及短期血糖控制水平与角膜不同层次，不同区域CD值均无明显相关性；
仅反映患者血糖长期控制水平的HbA1c与角膜中层＞2～6 mm直径区域CD值呈正相关，这也提示我们，对于长期血糖控制不佳的患者，其角膜病变早期可能出现在角膜中层近中央区域。
本研究对比分析角膜不同层次、不同直径区域范围内的CD值，用偏相关系数控制相关因素后，进一步分析代表T2DM患者长期（HbA1c）、中期（GA）、短期（GA/HbA1c）血糖控制水平的指标与CD值的相关性，分析数据更加全面，可信度更高。然而，本研究也存在一定局限性：早期研究显示糖尿病患者的角膜敏感性和神经纤维密度降低[19]，本研究未行相关检查，未能进一步分析神经纤维密度降低与CD的关系。
综上所述，T2DM患者的CD较健康人群明显增加，且CD先于CV、CT和ECD出现变化。角膜局部区域CD主要与糖尿病持续时间和长期血糖控制水平相关，与中期和短期血糖控制水平无明显相关性。CD的测量可能提供关于角膜微观结构变化的进一步信息，并可能为慢性高血糖引起的角膜病变的病理生理机制提供新的研究方向，从而成为诊断糖尿病角膜病变的敏感指标。
利益冲突申明本研究无任何利益冲突
作者贡献声明李盼盼：收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释；
撰写论文；
获取研究经费。李俊杰：收集数据，参与选题、设计及资料的分析和解释；
撰写论文。朱妍：参与选题、设计和修改论文。龚烨 ：收集数据，参与选题、设计及资料的分析。李晶晶：收集数据，参与选题、设计。宋愈：参与选题、设计、资料的分析和解释，修改论文中关键性结论