谭金曲，周 君，孙光华，刘丹妮，黄夏荣，罗 敷，周桂娟，屈萌艰，彭 婷，曾亚华
（南华大学衡阳医学院附属第一医院，湖南 衡阳 421001）
急性肺损伤（acute lung injury,ALⅠ）是各种原因导致的以低氧血症为特征，最终导致呼吸衰竭的临床病症[1]。ALⅠ的病理核心是炎症反应，PⅠNK1是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，与自噬、凋亡、氧化应激、释放突触递质和线粒体钙离子稳态等有密切联系，Parkin 是PⅠNK1 的 下游 蛋白[2]。研 究发 现PⅠNK1/Parkin 介导的线粒体自噬参与ALⅠ炎症反应[3]。调控PⅠNK1/Parkin 表达，促进线粒体自噬，可以抑制炎症反应、细胞焦亡，起到保护肺组织的作用，可作为治疗靶点。电针对ALⅠ有确切的治疗作用，能明显缓解ALⅠ炎症反应、减轻肺水肿[4]，但电针治疗急性肺损伤的机制尚未完全阐明。本次研究通过观察经电针预处理后ALⅠ大鼠血清中白细胞介素-6（interleukin-6, ⅠL-6）和转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）等炎症因子水平及肺组织中PⅠNK1、parkin 蛋白表达的变化，探讨电针对ALⅠ的疗效及机制，为电针防治ALⅠ提供一定实验依据。
1.1 实验动物24 只3 月龄清洁级雄性大鼠，体质量（327.0±10.7）g，购买自湖南省斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号为SYXK（湘）2020-0002。饲养于南华大学实验动物中心，动物分笼饲养，盒笼备有垫料、饲料和饮水，将室温调至20-26 ℃，将湿度调至50-60%，模拟正常昼夜更替。常规饲养1 周后开始实验。实验所需操作均符合我国《实验动物管理条例》及我院伦理委员会（ 批准号：202012100289）的相关规定。
1.2 主要试剂与仪器 试剂：常规化学试剂、Tween-20、APS：中国上海国药（货号：71033942、10002618、30189328）；
Tris、甘 氨 酸：美 国Sigma（货 号：Ⅴ900483、Ⅴ900144）；
蛋白酶抑制剂、蛋白磷酸酶抑制剂：上海爱必信生物科技有限公司（货号：583794、P1260）；
显影液、定影液：中国上海佳信（BW-61、BW-62）；
LPS：北京百奥莱博科技有限公司（货号：BK-001）。仪器：台式冷冻离心机：济南童鑫生物科技有限公司（货号：H1650R）；
电泳仪、电泳槽、转膜仪：中国北京六一（货号：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）；
电子天平：美国双杰（货号：JJ224BC）；
普通冰箱：中国奥克斯（货号：BCD-196A）；
PCR 仪、荧光PCR 板：湖南中美仪器有限公司（货号：HD4925、GL-88B）。
1.3 分组及造模24 只大鼠参照随机数字表法进行分组，分别为空白对照组、ALⅠ组和电针预处理组，每组8 只。ALⅠ造模参照脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）尾静脉注射方法[5-6]，具体操作：选取大鼠尾静脉1/3 处进行碘酒消毒，扩张局部血管，1 ml 注射器抽取溶解好的LPS 溶液（剂量5 mg/kg，浓度5 mg/ml），斜45°进针后平行进针，回抽见静脉血后注入LPS。
1.4 电针预处理操作 电针预处理组于大鼠造模前进行电针预处理。具体操作：选取双侧“尺泽”、“足三里”穴，参照中国针灸学会实验针灸研究制定的《动物针灸穴位图谱》进行定位，“尺泽穴”在大鼠肘弯横纹偏外的凹陷中，“足三里”穴在膝关节后外侧，在腓骨小头下约3mm 处。采用长度40 mm、直径0.25 mm 的华佗牌一次性无菌针灸针刺入，进针后，针柄接电针，波形为疏密波，疏波频率3 Hz，密波频率15 Hz；
强度以局部肌肉轻微收缩为度（约1.0 mA）。每次30 min，每天1次，共预处理5天。
1.5 实验过程 各组大鼠适应性喂养1 周后开始正式实验。电针预处理组进行电针预处理5 天，空白对照组和ALⅠ组常规饲养5 天。5 天后电针预处理组和ALⅠ组开始造模，空白对照组不造模。造模6 h后，三组大鼠进行麻醉取材。
1.6 实验取材
1.6.1 血清10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，眼眶采血约1 mL，放入离心机，以转速3000 r/min 离心30 min，使用移液枪取上清液至冻存管，并保存于-80 ℃冰箱，用于ELⅠSA检测。
1.6.2 肺组织 大鼠取血后处死，并将其仰卧于鼠板上，胸前及上腹部剪毛备皮，局部皮肤碘酒消毒，用剪刀逐层剪开胸腔取出肺组织，取1/2 左下肺组织进行HE 染色；
1/2 右下肺组织放入冻存管，并保存于液氮罐中，用于荧光定量PCR和WB检测。
1.7 标本检测
1.7.1 HE 染色及病理评分 将大鼠左上肺组织进行包埋、切片，脱蜡、复水；
滴加苏木精染色液染色，清洗后返蓝，再冲洗，取伊红试剂染色，晾干固定好，光学显微镜下观察形态变化后，根据以下肺组织病理变化评分标准进行评分。评分标准[7]：①肺泡充血；
②出血；
③肺泡腔或血管壁中性粒细胞浸润或聚集；
④肺泡壁增厚和（或）透明膜形成。分别依病变轻重评为0-4分：0分指无病变或非常轻微病变；
1分为轻度病变；
2 分为中度病变；
3 分为重度病变；
4分为极重度病变。
1.7.2 血清ⅠL-6 和TGF-β1 含量检测 采用ELⅠSA 检测方法，严格按照试剂说明书操作，检测血清ⅠL-6和TGF-β1水平。
1.7.3 PⅠNK1、parkin 的mRNA 表达 采用荧光定量PCR 检测PⅠNK1、parkin 的mRNA 表达。具体操作：提前准备好RNA 提取所需器械和试剂后。Trizol 提取组织总RNA，然后RNA 反转录以组织总mRNA 为模板，逆转录cDNA，逆转录产物用于PCR 反应和荧光定量PCR 反应。以cDNA 为模板加入靶基因上下游引物进行扩增，β-actin 为内参，引物序列见表1。实验之后记录PCR 仪测定的Ct值，按2-△△Ct（目的基因的相对表达量）方法进行实验数据处理，分析PⅠNK1、parkin的mRNA表达情况。引物信息见表1。
表1 引物信息
1.7.4 PⅠNK1、parkin 的蛋白 表达 采用WB 检测PⅠNK1、Parkin 蛋白在细胞中的表达。具体操作：剪取0.025 g组织，经PBS清洗、研磨、裂解、离心后，取上清液移入离心管存于液氮罐中；
取160 μL 蛋白上清液进行WB 检测，经电泳（电泳恒定电压75 Ⅴ，时间为130 min）、转膜（转膜300 mA 恒定电流，Parkin 约72 min，PⅠNK1 约83 min）、封闭、一抗及二抗孵育，孵育后用滤纸吸尽液体，用塑封膜将膜包裹杂交膜，在暗盒内与X 胶片曝光1-30 min，最后显影冲洗。扫描底片，分析细胞中PⅠNK1、parkin 蛋白表达含量。
1.8 统计学分析 符合正态分布的计量资料均使用均数加减标准差（±s）表示，不符合正态分布用四分位数和四分位数间距表示。应用SPSS 23.0 软件进行数据分析，多组间采用单因素方差分析。两两比较方差齐时，事后检验采用LSD 检验；
方差不齐时，则采用Dunnett T3检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠实验完成情况 实验过程顺利，动物无脱失、死亡，取材时正常组因麻醉过量死亡1 只大鼠，缺少一个血清标本，其余标本均送检，进行数据分析。
2.2 电针预处理对ALⅠ大鼠肺组织病理结构改变的影响 肺组织HE 染色结果显示，ALⅠ组大鼠肺组织有明显的充血及出血表现，部分肺泡结构消失、融合，其内渗出明显，伴大量炎性细胞聚集，部分肺泡壁显著增厚。电针预处理组的肺组织轻度充血，肺泡有部分融合，但大部分结构清晰可见，肺泡腔内无透明膜形成，肺泡隔内少量炎性细胞聚集。空白对照组的肺组织结构正常，无明显损伤、炎性细胞浸润，见图1。肺组织病理评分结果显示，ALⅠ组的肺损伤评分较空白对照组增高（P＜0.01）；
电针预处理组较ALⅠ组显著降低（P＜0.01），见图2。
图1 各组大鼠造模6 h后肺组织的病理切片（HE染色×200倍）
图2 各组大鼠造模6 h后肺组织病理评分的比较（± s，8只鼠/组）
2.3 电针预处理对ALⅠ大鼠血清ⅠL-6 和TGF-β1 含量的影响ALⅠ组血清TGF-β1 表达较空白对照组明显降低（P＜0.01），血清ⅠL-6 较空白对照组有升高趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）；
电针预处理组血清TGF-β1较ALⅠ组有上升趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05），血清ⅠL-6较ALⅠ组有下降趋势，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。
图3 各组大鼠造模6 h后血清ⅠL-6和TGF-β1含量比较（± s，7只鼠/组）
2.4 电针预处理对ALⅠ大鼠肺组织中PⅠNK1、parkin mRNA 表达的影响ALⅠ组PⅠNK1 mRNA 表达较空白对照组显著增高（P＜0.01），parkin mRNA 表达较空白对照组明显增高（P＜0.01）；
电针预处理组PⅠNK1 mRNA 表达较ALⅠ组降低（P＜0.01），parkin mRNA表达较ALⅠ组显著降低（P＜0.01）。见图4。
图4 各组大鼠造模6 h后肺组织PⅠNK1、parkin的mRNA表达水平的比较（± s，8只鼠/组）
2.5 电针预处理对ALⅠ大鼠肺组织中PⅠNK1、parkin蛋白表达的影响ALⅠ组PⅠNK1 蛋白表达较空白对照组明显增高（P＜0.01），parkin 蛋白表达较空白对照组明显增高（P＜0.01）；
电针预处理组PⅠNK1 蛋白表达较ALⅠ组降低（P＜0.01），parkin蛋白表达较ALⅠ组有降低趋势，但组间差异无统计学意义（P＞0.05）。见图5、图6。
图5 各组大鼠造模6 h后肺组织PⅠNK1、parkin蛋白表达水平的比较（± s，8只鼠/组）（WB蛋白检测）
图6 各组大鼠造模6 h后肺组织PⅠNK1、parkin的蛋白相对表达量的比较（± s，8只鼠/组）
ALⅠ高发病率、死亡率，严重威胁病人生命安全，寻找安全有效治疗手段有重要意义[8]。目前，临床上引起ALⅠ最常见的原因为革兰氏阴性细菌所致的重症感染[9]，而LPS 作为革兰阴性菌细胞壁主要成分之一[10]。LPS 进入体内，激活免疫反应，促炎与抑炎平衡失调，爆发炎症反应、肺组织发生充血水肿[11]，形成内毒素性ALⅠ[12]。因此，LPS 诱导的ALⅠ的病理机制与过度的炎症反应密切相关[13]。另外，LPS 会增加胶原沉积、羟脯氨酸以及Ⅰ型胶原含量，诱导上皮间质转化过程，刺激肺组织TGF-β1 生成[14]，最终形成肺部纤维化及空间重构[15]。
电针具备简便验廉、安全可靠的特点，广泛应用于临床各类疾病，本次实验探究电针在ALⅠ的作用及其机制。研究中电针预处理组中穴位选择双侧“尺泽”“足三里”穴，电针参数选用：波形为疏密波3/15 Hz；
强度以局部肌肉轻微收缩为度(约1.0 mA)。疏密波使肌肉有节律的收缩，促进组织代谢，以消除炎症水肿[16]。研究显示，低频率、轻刺激在肺损伤的应用较多，能有效减轻炎症缓解肺损伤[17-22]。穴位处方中“尺泽穴”善治咳喘、气逆等肺部病症，“足三里穴”有扶正、培土生金之功，二穴相配共奏祛邪扶正、标本兼治之效。前期研究[23]发现电针预处理可以减轻ALⅠ大鼠的炎症反应。同样，本次研究结果中也显示，经LPS 复制的ALⅠ大鼠肺组织结构破坏，炎症水肿明显，电针预处理可有效预防损伤，减轻造模后炎症反应。
近年来研究发现多种细胞因子参与肺损伤形成，它们相互协调、相互拮抗。在众多促炎性细胞因子中，ⅠL-6是LPS诱导ALⅠ的重要炎性因子之一，在参与ALⅠ炎症反应的同时，能作为中间物质激活其他炎性因子，诱导肺泡上皮细胞和内皮细胞损伤，促进ALⅠ的发生、发展[24]。ALⅠ早期即可见TGF-β1 被激活，激活后的TGF-β1 导致肺泡毛细血管的通透性增加，诱发肺水肿及炎症因子的释放[25]。而且，TGF-β1 可诱导胶原分子生成过量，沉积在上皮进而造成气道重塑。同时，TGF-β 还可激活基质金属蛋白酶分解肺组织细胞外基质,启动上皮间充质化，导致气道上皮屏障功能受损[26]。因此抑制过度炎症反应，阻止肺上皮-间质转化，能有效的控制疾病的发展，造成不可逆损伤，降低病死率。研究发现，LPS 诱导形成ALⅠ过程中，PⅠNK1 以及Parkin蛋白含量明显上升，细胞焦亡数量增加，线粒体自噬能力增强[27]。可以清除受损肺组织细胞、减轻炎症反应。同时也有发现PⅠNK1/Parkin 蛋白不断增加，会加重肺部损伤，促进肺上皮细胞坏死凋亡[2,28-29]。本次研究结果显示，ALⅠ大鼠血清中ⅠL-6含量增加，血清中TGF-β1 含量降低，经电针预处理的ALⅠ大鼠血清中ⅠL-6 表达减少、TGF-β1 含量上升。本次结果中TGF-β1 的表达与以往研究结果不一致，可能跟数据少有关，需进一步实验验证。ALⅠ组PⅠNK1、Parkin 蛋白表达明显上升，说明造模后的大鼠肺组织中自噬蛋白表达增加，电针预处理组较ALⅠ组含量减少，同时血清中炎症因子（ⅠL-6）表达下调，可能是电针预处理后的ALⅠ大鼠消耗自噬蛋白吞噬炎性细胞、焦亡细胞，从而改善炎症反应。
综上所述，电针预处理能减轻LPS 诱导的大鼠ALⅠ炎症反应，可能与PⅠNK1/Parkin蛋白表达有关，该实验结果可为电针防治ALⅠ提供依据，为治未病思想提供实验基础，同时也可将针灸用于急危重症中。但结论仍需更多的实验论证，以及进一步研究其相关通路，以期更加全面的证实电针在ALⅠ中的防治作用。
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