吴沛园，王晓蝶，刘鑫，武崇光，吉宁，王秀芳，吕占军
河北医科大学河北省实验动物重点实验室遗传研究室，河北 石家庄 050017
短散布核元件（short interspersed nuclear elements，SINEs）在哺乳动物基因组中广泛存在，占人类基因组的13%，啮齿类基因组的8%［1］。人类基因组中主要的SINE 是Alu 元件，而B1 元件是小鼠基因组中主要的SINE。已证明基因组中的Alu 和B1 元件由RNA 聚合酶Ⅲ转录产生SINE RNA；
而包埋在基因中的SINE 元件由RNA 聚合酶Ⅱ转录产生SINE RNA。这些RNA 发挥重要的生物学作用［2］。Alu RNA 的聚集与多种人类疾病的不良预后有关［3］。小鼠B1 RNA和人类Alu RNA在阿尔茨海默病（Alzheimer，s disease，AD）患者的大脑中表达上升，且随病情加重其表达增加，Alu RNA增加导致AD患者基因表达改变［4］。
其他RNA 包括microRNA、小激活RNA、非编码RNA 等，也被证明在调节基因表达方面发挥重要作用［5-7］。有些RNA有望成为治疗癌症、肾脏、肝脏和心血管疾病的有效药物［8-9］。为了研究RNA在细胞内以及动物体内的生物学作用，本研究室前期已建立了制备无内毒素污染的基因工程RNA的方法［10-11］，并制备了可用于细胞实验以及动物体内实验的基因工程Alu正义和反义RNA，以及小鼠B1正义和反义RNA。有文献报道，将RNA直接转染细胞或注射入动物体内，RNA很快降解，影响其发挥生物学作用［11］。
本研究将20 μg B1反义RNA（B1 antisense RNA，B1as RNA）经尾静脉单次注射正常BALB／c 小鼠，并转染培养的小鼠胚胎细胞，分析B1as RNA 在小鼠血液样本和不同组织样本（包括心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和胸腺组织）中的生物分布以及细胞摄取B1as RNA的效率。
1.1 B1as RNA B1as DNA 模板单链（5"-GCGGCAGCCATATGGCTAGCTTTTTTTTTTCGAGACAGGGTTTCTCTGTG-3"，50 nt）由北京赛百盛基因技术有限公司（SBS 公司）合成；
无内毒素污染的基因工程小鼠B1as RNA（纯B1as RNA 占总RNA 的15.8%）和无关对照LacZ3F3R RNA（LacZ3F3R 属于大肠埃希菌LacZ基因的第3 个280 bp 片段）均由本实验室前期制备［10-11］。
1.2 实验动物 SPF 级BALB／c 小鼠，8 ～12 周龄，雌雄各半，体质量（20.41±1.87）g，由河北省实验动物中心提供，动物合格证号：1804151；
SPF 级自然衰老的BALB／c 小鼠（≥14 月龄），雌雄各半，体质量（31.15±4.13）g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0008。所有动物实验过程均经河北医科大学实验动物伦理与福利委员会批准（批准号为IACUC-Hebmu-2021009）。
1.3 主要试剂及仪器 RevertAid 第一链cDNA 合成试剂盒购自美国Thermo Scientific 公司；
BlazeTaq™SYBR®Green qPCR Mix 2.0 试剂盒购自美国Gene Copoeia 公司；
DMEM 培养基购自美国Gibco 公司；
胎牛血清（fetal calf serum，FCS）购自美国ZETATM Life公司；
胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司；
TRlzol 试剂购自北京赛百盛基因技术有限公司（SBS公司）；
7500 Real-Time PCR 系统由美国Applied Bio systems公司生产。
1.4 动物分组及处理 取6 只8 ～12 周龄BALB／c小鼠，雌雄各3只，经尾静脉注射20 μg B1as RNA，分别于注射后0、5、10、15、30、60、240 min 经小鼠眼眶静脉丛采血，检测B1as RNA 在小鼠血液中的生物分布。
取54 只8 ～12 周龄BALB／c 小鼠，经尾静脉注射20 μg B1as RNA，注射后0.5、2、4、8、16、24、48、72、96 h 分别用CO2安乐处死6 只小鼠，雌雄各3 只，解剖小鼠，取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和胸腺，检测B1as RNA 在不同组织的生物分布，以静脉注射生理盐水的小鼠作为对照组。
将30 只自然衰老的BALB／c 小鼠（≥14 月龄）分成3组：治疗组（经尾静脉注射20 μg B1as RNA，每周1 次）、无关RNA 对照组（经尾静脉注射20 μg LacZ3F3R RNA，每周1 次）和盐水对照组（注射相同体积的盐水），每组10 只，另设年轻对照组（正常年轻的8 ～12 周龄BALB／c 小鼠，雌雄各5 只）。给药4 周后，用CO2安乐处死各组小鼠，迅速取出肝脏组织，检测衰老相关基因的表达水平。
1.5 小鼠胚胎细胞培养及B1as RNA 转染 麻醉情况下处死妊娠16 d的BALB／c小鼠。以下过程均无菌操作：从小鼠体内取出胚胎，用DMEM 培养基洗涤3次，将胚胎切成约1 mm3的小块，用10%FCS-DMEM培养基培养于25 mL 培养瓶中，48 h 后更换培养基，冲掉未附壁的组织块；
培养4 d 后，小鼠胚胎培养细胞达80%融合，用胰蛋白酶消化，接种于24 孔板中，1×105个／孔，于37 ℃，5%CO2条件下培养24 h；
转染B1as RNA［在细胞的10%FCS-DMEM 培养基中补充5 μL 1 mg／mL 的B1as RNA-CaCl2（1 mg／mL B1as RNA含3 mmol／L CaCl2）］，继续培养，分别于培养5 min（1／12 h）、15 min（1／4 h）、45 min（3／4 h）、1.5 h、3 h、6 h、12 h 和24 h 取一定量的细胞，提取细胞总RNA，检测细胞摄取B1as RNA的效率。
1.6 总RNA 的提取 用TRIzol 试剂提取注射B1as RNA不同时间点采集的小鼠血液和组织样本以及转染B1as RNA 后不同时间点收集的小鼠胚胎细胞RNA，按试剂盒说明书操作。
1.7 小鼠血液及组织样本中B1as RNA 生物分布的检测 采用RT-qPCR 法。为使RT-qPCR 检测到的B1as RNA 属于注射的B1as RNA，而不是细胞本身的B1as RNA，扩增B1as RNA时所需上游引物属于pET-28α 质粒的多克隆位点序列，下游引物与B1as RNA互补，上游引物序列：5"-GCGGCAGCCATATGGCTAGC-3"，下游引物序列：5"-CACAGAGAAACCCTGTCTCG-3"，扩增片段长度为72 bp；
β-actin上游引物序列：5"-CTGTGCCCATCTACGAGGGCTAT-3"，下游引物序列：5"-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3"，扩增片段长度为155 bp。引物由SBS 公司合成。引物设计示意图见图1。
提取的总RNA 经乙醇沉淀后，溶于焦碳酸二乙酯处理过的双蒸水中，使用RevertAid第一链cDNA 合成试剂盒在20 μL 反应体系中进行逆转录，反应条件为：25 ℃10 min，42 ℃60 min，72 ℃10 min，孵育于冰上。用7500 Real-Time PCR系统进行PCR 扩增，使用BlazeTaq™SYBR®Green qPCR Mix 2.0 试剂盒在20 μL 反应体系中加入2 μL逆转录产物，反应条件为：95 ℃2 min，95 ℃10 s，53 ℃40 s，共40 个循环［12］。以小鼠β-actin作为内参对照。
图1 检测注射的B1as RNA时所使用的引物设计示意图Fig.1 Schematic design of primers used to detect injected B1as RNA
1.8 小鼠胚胎细胞摄取B1as RNA 的效率检测 采用RT-qPCR 法。根据A260值计算B1as DNA 模板数量，根据DNA 模板数量及其分子量计算摩尔浓度。根据拷贝数将B1as DNA 模板分别稀释为0、101、102、103、104、105、106、107和108拷贝／μL。提取未转染B1as RNA 的小鼠胚胎细胞总RNA，逆转录为cDNA，用cDNA 溶液作为B1as DNA 模板的稀释剂。以qPCR得到的平均Ct值为纵坐标，拷贝数为横坐标绘制标准曲线。根据RT-qPCR 获得的样品Ct值，对照标准曲线，得到每μL总RNA溶液中B1as RNA分子数，按下式计算细胞摄取B1as RNA的效率。
式中cDNA 拷贝数=B1as RNA 拷贝数；
事实上，由于逆转录效率低于100%，检测到的cDNA 拷贝数低于B1as RNA。
1.9 小鼠肝脏组织中衰老相关基因表达的检测 用TRIzol试剂从小鼠肝脏组织中提取总RNA，采用RTqPCR法检测衰老相关基因Sirt1、p21、p16INK4a、p15INK4b、p19Arf的表达水平，具体操作按1.7项，引物序列见表1。
表1 检测衰老相关基因使用的引物Tab.1 Primers used to detect aging-related genes
1.10 统计学分析 采用IBM SPSS Statistics 24.0 软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 B1as RNA在正常BALB／c小鼠血液中的生物分布 RT-qPCR检测结果显示，雌性和雄性小鼠血液样本中B1as RNA 水平无差异，因此将两种性别的结果一起分析。注射B1as RNA 5 min后，即可在小鼠外周血样本中检测到B1as RNA（t=5.366，P＜0.05）；
注射后15 min，B1as RNA在血液样本中的存留量达最高值（t=9.055，P＜0.05）；
注射后30 min，仍可在血液样本中检测到B1as RNA的存留（t=7.355，P＜0.05），但其水平显著低于15 min；
注射60 min后，已检测不到B1as RNA，表明B1as RNA在血液中被迅速清除。见图2。
图2 正常BALB／c小鼠外周血中B1as RNA的生物学分布Fig.2 Biodistribution of B1as RNA in peripheral blood of normal BALB／c mice
2.2 B1as RNA在正常BALB／c小鼠不同组织中的生物分布 RT-qPCR检测结果显示，注射B1as RNA 0.5 h，在小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏中可检测到注射的B1as RNA（t分别为24.77、19.35、3.431和36.74，P均＜0.05），在肺中未检测到；
注射后2、4、8、16、24 和48 h，在小鼠肺中可检测到B1as RNA（t分别为5. 914、13. 94、24.08、8.406、5.149和2.894，P均＜0.05）。见图3。
图3 B1as RNA 在正常BALB／c 小鼠不同组织中的生物分布Fig.3 Biodistribution of B1as RNA in different tissues of normal BALB／c mice
2.3 小鼠胚胎细胞摄取B1as RNA的效率 B1as DNA模板的扩增曲线和模板单链的标准曲线见图4 和图5。培养的小鼠胚胎细胞见图6。RT-qPCR 检测结果显示，转染B1as RNA后5 min（1／12 h，t=5.948，P＜0.05）、15 min（1／4 h，t=21.0，P＜0.05）、45 min（3／4 h，t=16.39，P＜0.05）、90 min（1.5 h，t=4.121，P＜0.05）和180 min（3 h，t=3.930，P＜0.05），在培养的小鼠胚胎细胞中均可检测到B1as RNA，之后逐渐消失，且B1as RNA水平在转染后45 min达峰值，Ct值为19.46，培养的小鼠胚胎细胞摄取B1as RNA的效率约为每个细胞摄取400个B1as RNA分子。见图7。
图4 B1as DNA模板的扩增曲线Fig.4 Amplification curve of B1as DNA template
图5 B1as DNA模板单链的标准曲线Fig.5 Standard curve of B1as DNA template single strand
图7 转染后不同时间B1as RNA 在培养的小鼠胚胎细胞中的相对水平Fig.7 Relative levels of B1as RNA in cultured mouse embryo cells at different times after transfection
2.4 B1as RNA 对小鼠肝脏组织中衰老相关基因表达的影响 RT-qPCR 检测结果显示，与年轻对照组小鼠比较，盐水对照组小鼠肝脏组织中p21、p16Ink4a、p15Ink4b、p19Arf基因mRNA 的表达水平显著上升（t分别为35.33、4.434、7.821和43.00，P均＜0.01），Sirt1基因mRNA的表达水平显著下降（t=7.895，P＜0.01）；
与盐水对照组比较，治疗组p21、p16Ink4a、p15Ink4b、p19Arf基因mRNA的表达水平显著下降（t分别为10.01、4.461、4.420 和5.309，P均＜0.05），Sirt1基因mRNA 的表达水平显著升高（t=4.579，P＜0.05）。见图8。
图8 B1as RNA 对小鼠肝脏组织中衰老相关基因表达的调节作用Fig.8 Regulation of B1as RNA on expression of agingrelated genes in mouse liver
续图8 B1as RNA 对小鼠肝脏组织中衰老相关基因表达的调节作用Fig.8（Continued）Regulation of B1as RNA on expression of aging-related genes in mouse liver
本研究室前期已建立了用大肠埃希菌BL21（DE3）制备基因工程RNA 的方法［10］，从大肠埃希菌中制备RNA的主要问题为内毒素（细菌脂多糖）的污染。内毒素可引起哺乳动物发热、炎症、细胞和组织损伤，甚至出现不可逆休克或死亡［13］。为了去除基因工程RNA 中的内毒素，本研究室又建立了用SDS-NaCl 过滤联合Triton X-114 相分离法制备基因工程RNA 的方法［11］。该方法可有效去除基因工程RNA 中污染的内毒素。这些方法的建立使在细胞体外水平和动物体内水平研究RNA的功能成为可能。
已有越来越多的研究证明内源性和外源性RNA具有重要的生物学作用，内源性RNA 可调控基因表达［14-16］。人工合成的siRNAs转染至培养的哺乳动物细胞，在进入RNA诱导沉默复合物后，降解靶mRNA，并抑制基因表达［17］。最近的研究表明，通过RNA 小分子控制基因表达可能是未来基因治疗的重要措施［18］。SINEs 是哺乳动物基因组中最重要的重复序列。SINE 元件被RNA 聚合酶Ⅲ转录，产生长度为100 ～500 个核苷酸的RNA 分子。SINE RNAs 在调控基因表达中起关键作用［19］。已有研究证明，SINE正义和反义RNA的产生与肿瘤抑制基因BRCA1mRNA的下调有关［20］。
如使RNA 在细胞和动物组织中发挥生物学作用，其需进入细胞并在细胞中停留一定时间，但一般认为RNA 进入细胞后会很快降解［11］。近年来有文献报道了不同RNA 在细胞中的半衰期，差异很大，内含子RNA 的半衰期可短至5 min，mRNA 的半衰期可长至24 h［21］。SHAROVA 等［22］检测了小鼠胚胎干细胞，发现mRNA 的半衰期中位数为7.1 h。也有文献报道，RNA 在血液样本中被迅速降解［23］。细胞产生的RNA 和转染进入细胞的RNA 均易被降解（从数分钟到几十小时），但RNA 通过影响基因转录发挥作用，由于转录本身有激活基因的作用，称为RNA激活，因此RNA 虽易被降解，但其导致的影响会长期存在［24］。
本研究首次分析了基因工程鼠B1as RNA 在BALB／c小鼠血液样本和不同组织中的药代动力学。经小鼠尾静脉单次注射20 μg B1as RNA 后5 min，可在小鼠血液样本中检测到注射的B1as RNA；
15 min后，注射的B1as RNA 在血液样本中的水平达峰值；
注射后30 min，有少量存留；
60 min 后几乎检测不到注射的B1as RNA 在血液样本中存留。采用RTqPCR 法检测B1as RNA 在正常BALB／c 小鼠不同组织中的生物学分布，结果显示，静脉注射30 min 时，在小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏和胸腺中可检测到注射的B1as RNA，但未在肺中检测到；
注射2 ～48 h，在小鼠肺中检测到注射的B1as RNA。上述结果显示，B1as RNA 在血液中维持的时间较短（30 min），而在所有检测到的组织中维持时间较长（约2 h），尤其在肺中持续的时间最长，可达48 h。ZHAO等［12］报道，DNA疫苗在组织中的持续时间比在血液样本中的持续时间更长，在肺中的持续时间最长。本研究结果与ZHAO 等的报道一致。BRÅVE 等［25］报道，DNA 质粒在肺部停留时间长的原因之一是质粒暂时滞留在肺泡周围毛细血管的细网中。因此本研究认为，B1as RNA在肺部停留时间长的原因也可能与此有关。
进行RNA 生物学作用研究时常用细胞作为模型，为了检测B1as RNA能否进入培养的细胞，本研究用培养的小鼠胚胎细胞作为模型进行研究。将B1as RNA 转染培养的小鼠胚胎细胞后，采用RT-qPCR 法检测转染后不同时间B1as RNA 在细胞中的存留水平，结果显示，转染后45 min，B1as RNA 水平在细胞中达峰值，此时小鼠胚胎培养细胞摄取B1as RNA 的效率约为每个细胞摄取400个B1as RNA分子。
以往的研究已使用自然衰老的BALB／c小鼠证明了B1as RNA 具有抗疲劳和抗氧化的活性，并能清除衰老小鼠细胞中积累的活性氧［26］。本研究进一步观察B1as RNA对自然衰老小鼠衰老相关基因表达的影响。将B1as RNA经静脉注射自然衰老的BALB／c小鼠，可调节衰老相关基因的表达水平。编码p16Ink4a、p19Arf和p15Ink4bmRNA的Ink4／Arf基因座的表达在衰老过程中逐渐增加，一项全基因组关联研究已将Ink4／Arf基因座与人类多种衰老相关疾病和衰老联系起来［27］。p21是一种细胞周期进程的抑制剂，随着年龄的增长而增加，并抑制衰老生物体的细胞再生。据报道，p21缺乏可部分防止年龄引起的细胞增殖和组织功能下降［28］。Sirt1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖的去乙酰化酶，可抑制哺乳动物衰老相关疾病的发生［29］。Sirt1 可影响多种生物学功能，包括线粒体稳态、DNA修复、肿瘤抑制等。越来越多的证据表明，Sirt1 活性的提高可抑制哺乳动物的衰老和衰老相关疾病的发生［30-31］。本研究发现，B1as RNA 可显著降低Ink4／Arf和p21的表达水平，增加Sirt1的表达。这些结果提示，B1as RNA 可能通过调节衰老相关基因的表达来发挥其抗衰老作用。
本研究首次证明了基因工程鼠B1as RNA 可在小鼠血液中存留一定时间（15 min 达峰值），能够进入小鼠多种组织，在组织中存留较长时间（2 ～48 h）；
并证明将B1as RNA 转染培养的小鼠胚胎细胞，其可被体外培养的细胞有效摄取，并在细胞中停留90 min；
B1as RNA 进入小鼠肝脏，可调节肝脏细胞中衰老相关基因的表达。