陈吉 姚欢欢 李能
[摘要] 目的 探究含活血通絡方血清调控IncRNA MEG3对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells，hRMECs）增殖及凋亡的影响作用。方法 选取20只SD大鼠，采用随机数字表法对10只大鼠灌胃活血通络方，10只灌胃等量生理盐水。灌胃结束1h后制备相应血清。分别采用5mmol/L葡萄糖或30mmol/L的D-甘露醇、葡萄糖溶液对hRMECs细胞进行诱导24h。按照诱导情况将细胞分为正常对照组（5mmol/L葡萄糖，n=6）、等渗组（30mmol/L D-甘露醇，n=6）、高糖组（30mmol/L葡萄糖，n=6）、高糖+2.5%含药血清组（n=6）、高糖+7.5%含药血清组（n=6）、高糖+10%含药血清组（n=6），相应血清干预24h。采用CCK-8法、酶联免疫吸附法检测细胞增殖情况及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）含量；
采用实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR）测定细胞IncRNA-MEG3 mRNA表达，采用流式细胞术测定细胞凋亡情况；
采用蛋白免疫印迹法检测NOX4、VAV2、血管表皮生长因子受体（vascular epidermal growth factor receptor，VEGFR）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、p-AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR蛋白表达情况。结果 与正常对照组比较，高糖组细胞增殖率下降，MDA含量增加，GSH-Px含量降低，凋亡增加，IncRNA-MEG3 mRNA表达降低，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、NOX4、VAV2、VEGFR蛋白表达均升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与高糖组比较，高糖+7.5%含药血清组和高糖+10%含药血清组细胞增殖率增加，MDA含量降低，GSH-Px含量升高，IncRNA-MEG3表达升高，差异均有统计学意义（P<0.05）；
高糖+2.5%含药血清组、高糖+7.5%含药血清组、高糖+10%含药血清组的细胞凋亡下降，p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、NOX4、VAV2、VEGFR蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 含活血通络方血清可介导IncRNA-MEG3调控相关蛋白表达来减少高糖诱导hRMECs细胞的凋亡。
[关键词] 糖尿病视网膜病变；
活血通络方；
IncRNA-MEG3；
凋亡
[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.17.018
Study on the proliferation of human retinal microvascular endothelial cells induced by high glucose in Huoxue Tongluo formula containing serum
CHEN Ji1， YAO Huanhuan1， LI Neng2
1.Department of Pharmacy， Huzhou Third Peoples Hospital， Huzhou 313000， Zhejiang， China; 2.Department of Ophthalmology， Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou 310007， Zhejiang， China
[Abstract] Objective To investigate the effect of Huoxue Tongluo formula regulates IncRNA MEG3 on the proliferation and apoptosis of human retinal microvascular endothelial cells （hRMECs） induced by high glucose. Methods Twenty SD rats were selected and 10 rats were gavaged with Huoxue Tongluo formula and 10 rats were gavaged with equal amount of saline according to random number table method. The corresponding serum was prepared 1h after the end of gavage. The hRMECs cells were induced with 5mmol/L glucose or 30mmol/L D-mannitol， glucose solution for 24h. Cells were divided according to induction into normal control （5mmol/L glucose， n=6）， isotonic （30mmol/L D-mannitol， n=6）， high glucose （30mmol/L glucose， n=6）， high glucose+2.5% drug-containing serum （n=6）， high glucose+7.5% drug-containing serum （n=6） and high glucose+10% drug-containing serum （n=6） groups with the corresponding serum intervention for 24h. Cell proliferation and malondialdehyde （MDA） and glutathione peroxidase （GSH-Px） levels were measured by CCK-8 and ELISA. Cellular IncRNA-MEG3 mRNA expression was measured by quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction （qRT-PCR） and apoptosis was measured by flow cytometry. Protein immunoblotting was used to detect NOX4， VAV2， vascular epidermal growth factor receptor （VEGFR）， phosphoinositide 3-kinase （PI3K）， p-PI3K， protein kinase B （AKT）， p-AKT， mammalian target of rapamycin （mTOR）， p-mTOR protein expression. Results Compared with the normal control group， the high glucose group showed decreased cell proliferation rate， increased MDA content， decreased GSH-Px content， increased apoptosis， decreased IncRNA-MEG3 mRNA expression， and increased p-PI3K/PI3K， p-AKT/AKT， p-mTOR/mTOR， NOX4， VAV2， and VEGFR protein expression， all with statistically significant differences （P<0.05）. Compared with the high glucose group， the cell proliferation rate increased， MDA content decreased， GSH-Px content increased and IncRNA-MEG3 expression increased in the high glucose +7.5% drug-containing serum group and the high glucose+10% drug-containing serum group， all with statistically significant differences （P<0.05）. Apoptosis was decreased in the high glucose+2.5% drug-containing serum group， the high glucose+7.5% drug-containing serum group and the high glucose+10% drug-containing serum group， and p-PI3K/PI3K， p-AKT/AKT， p-mTOR/mTOR， NOX4， VAV2， VEGFR protein expression were decreased， all differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Huoxue Tongluo formula mediates IncRNA-MEG3-regulated protein expression to reduce apoptosis in hRMECs induced by high glucose.
[Key words] Diabetic retinopathy; Huoxue Tongluo formula; IncRNA-MEG3; Apoptosis
随着社会的发展和人口老龄化进程的不断加快，加上人群基因易感性，我国糖尿病患者的相对数量已超出许多国家[1]。糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病常见眼部并发症，主要病理改变为视网膜微血管病变和视网膜神经细胞功能障碍、退化[2]。糖代谢紊乱是导致DR的根本原因，持续的高血糖可损伤视网膜毛细血管内皮，继而引起眼部多种病理改变[3-4]。IncRNA MEG3表达下调能够加重DR小鼠视网膜血管功能障碍[5]。活血通络方具有益气活血、通目络之功效，对糖尿病大鼠的视神经组织具有保护作用[6]。基于此，本研究通过体外实验，探讨活血通络方对高糖诱导人视网膜血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells，hRMECs）的保护作用及对IncRNA MEG3的调控作用。
1 材料与方法
1.1 动物及材料
SPF级雄性SD（sprague–dawley）大鼠，体质量（220±20）g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物生产许可证号：SCXK（沪）2017-0005]。在浙江鹰旸生物科技有限公司动物中心[动物使用许可证号：SYXK（浙）2020-0033]进行常规饲养。饲养期间自由饮食水，保证每天光照12h，温度20～22℃，相对湿度50%～70%。本研究经湖州市第三人民医院伦理委员会审批（伦理批准号：ZJEY-20211116-03）。
hRMECs细胞购自美国Angio Proteomie公司，活血通络方由医院药房提供；
胎牛血清购于美国Transgen Biotech公司，DMEM培养基购于美国HyClone公司；
CCK8试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；
丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）检测的酶联免疫吸附法试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司；
NOX4、VAV2、血管表皮生长因子受体（vascular epidermal growth factor receptor，VEGFR）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、p-AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p-mTOR蛋白抗体购于美国Affinity公司；
逆转录试剂盒购于西陇化工股份有限公司。Micro17R型低温高速离心机、BB150型细胞培养箱购于德国Thermo公司；
CMaxPlus型酶标仪购于美国Molecular Devices公司；
CFX Connect型实时荧光定量PCR仪购于美国Bio-Rad公司；
Mastercycler型PCR仪购于德国Eppendorf公司；
Nanodrop one型mRNA定量仪购于德国Thermo公司；
AE2000型显微镜购于美国Motic公司。
1.2 方法
适应性饲养SD大鼠1周。采用随机数字表法对10只大鼠灌胃活血通络方（42g/kg），10只灌胃等量生理盐水，连续5d。灌胃结束1h后，对两组大鼠进行颈动脉采血，离心得到含活血通络方血清和正常血清，–20℃保存备用。正常血清稀释，含活血通络方的血清分别制备2.5%、7.5%和10%浓度的药物血清。
采用10%胎牛血清的DMEM培养基培养hRMECs细胞，于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中传代细胞。随后采用5mmol/L葡萄糖、30mmol/L的D-甘露醇或葡萄糖诱导细胞24h[7]。按照诱导情况将细胞分为正常对照组（5mmol/L葡萄糖，n=6）、等渗组（30mmol/L D-甘露醇，n=6）、高糖组（30mmol/L葡萄糖，n=6）、高糖+2.5%含药血清组（n=6）、7.5%含药血清组（n=6）、10%含药血清组（n=6），相应血清干预24h。
1.3 观察指标
①细胞增殖检测：细胞接种于96孔板，吸弃上清培养基，更换新鲜培养基继续培养24h。每孔加入10μl的CCK-8试剂，孵育1h。孵育结束用酶标仪测定各细胞孔和设置孔在450nm处的吸光度值，计算相应细胞增殖率。②细胞MDA、GSH-Px指标检测：收集细胞，离心，吸取上清液进行收集。按照酶联免疫吸附法试剂盒说明书，设置空白、对照孔和实验孔，测定吸光度值，计算MDA含量及GSH-Px活性。③细胞lncRNA-MEG3mRNA表达检测：采用Trizol法提取RNA，采用逆转录聚合酶链反应进行DNA扩增（引物序列：F：5-CATCTACACCTCACG AGGG-3；
R：5-ATCCTTTGCCATCCTGGTC-3），實时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测IncRNA MEG3 mRNA表达。反应条件为变性95℃ 10min，扩增反应为95℃ 15s、60℃ 60s、40次，溶解曲线为95℃ 15s、60℃ 60s、95℃ 15s。采用2-△△CT法对结果进行相对定量分析。④细胞凋亡检测：细胞接种于6孔板内，吸弃多余细胞培养液。预冷PBS缓冲液洗涤，调整细胞浓度至1×106个/ml。加入500μl结合缓冲液与细胞混合，离心弃上清液，100μl结合缓冲液重悬细胞。加入5μl Annexin V-FITC和10μl碘化丙啶抗体，轻微振荡，室温避光环境下孵育15min。400μl结合缓冲液重悬混匀细胞，采用流式细胞仪进行检测。⑤细胞蛋白表达检测：细胞裂解，离心提取上清液备用。采用BCA法测定总蛋白含量。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白，转聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，封闭，以TBST缓冲液清洗。用稀释后的抗体NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR孵育，4℃摇床过夜。隔天取出后恢复室温，以TBST缓冲液清洗，对应二抗孵育2h，TBST缓冲液再次清洗。采用蛋白免疫印迹法检测，读取ECL-化学发光仪对应数值，以β-actin做内参，计算各蛋白的相对表达量。
1.4 统计学方法
采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（
）表示，组间比较采用Tukey分析，多组比较采用ANOVA单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 细胞增殖率比较
等渗组的细胞增殖率与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），高糖组细胞增殖率显著低于正常对照组（P<0.05）。高糖+7.5%含药血清组、高糖+10%含药血清组细胞的增殖率均显著高于高糖组（P<0.05），见图1。
2.2 MDA和GSH-Px含量释放情况比较
等渗组细胞MDA、GSH-Px含量与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。与正常对照组比较，高糖组细胞MDA含量显著上升，GSH-Px含量显著下降（P<0.05）。与高糖组比较，高糖+7.5%含药血清组、高糖+10%含药血清组的细胞MDA含量显著下降，GSH-Px含量显著上升（P<0.05），见表1。
2.3 lncRNA MEG3 mRNA表达水平比较
等渗组细胞的lncRNA MEG3 mRNA表达水平与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），高糖组细胞lncRNA MEG3 mRNA表达水平显著低于正常对照组（P<0.05）。与高糖组比较，高糖+7.5%含药血清组、高糖+10%含药血清组lncRNA MEG3 mRNA表达水平均显著增加（P<0.05），见表2。
2.4 细胞凋亡情况比较
等渗组细胞凋亡情况与正常对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05），高糖组细胞凋亡率显著高于正常对照组（P<0.05）。与高糖组比较，高糖+2.5%含药血清组、高糖+7.5%含药血清组、高糖+10%含药血清组细胞的凋亡率均显著下降（P<0.05），见图2。
2.5 对高糖诱导细胞蛋白表达的影响
等渗组细胞各蛋白表达与正常对照组比较，差异均无统计学意义（P>0.05），高糖组细胞NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达均显著高于正常对照组（P<0.05）。与高糖组比较，高糖+2.5%含药血清组、高糖+7.5%含药血清组、高糖+10%含药血清组细胞的NOX4、VAV2、VEGFR、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表达均显著降低（P<0.05），见图3、表3。
3 讨论
糖尿病的主要危害在于其各种并发症，持续的糖尿病病程与DR的病变程度增加有关[8]。DR的进展及病变分类包括血–视网膜通透性、血管内皮细胞减少、血管基底膜增厚、毛细血管闭塞、视网膜神经元和胶质异常等[9]。除了高血糖对内皮细胞的影响之外，过度的炎症和氧化应激反应可影响视网膜组织细胞正常增殖[10]。临床研究表明，活血通络方的辅助治疗对与DR患者的血糖控制及眼底渗血、出血、微血管瘤等症状改善均有显著作用[11]。
本研究结果显示，活血通络方除了能够减弱高糖对hRECs细胞增殖的抑制作用和促凋亡作用外，还能够减少MDA水平，增加GSH-Px活性，减轻高糖诱导hRECs细胞的氧化应激损伤，这可能与活血通络方的抗炎作用有关[11]。高糖环境会阻碍AKT表达并促进其磷酸化产物生成，激活下游信号通路进而造成视网膜内皮细胞凋亡[12]。Fang等[13]研究表明，PI3K/AKT/mTOR信号激活可加重视网膜上皮细胞坏死；
而IncRNA MEG3能够抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路表达，减轻糖尿病大鼠视网膜病变[14-15]。本研究结果显示，高糖诱导可抑制hRMECs细胞IncRNA MEG3表达，而活血通络方则可逆轉这一抑制作用，同时PI3K/AKT/mTOR信号通路的磷酸化产物相应减少，提示活血通络方可能通过促进IncRNA MEG3表达抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路表达，以减少高糖诱导hRMECs细胞凋亡。
血管表皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）参与调控视网膜血管新生，因此VEGF抑制剂被用于DR治疗[16]。李聪翀等[17]发现VEGF/VEGFR2/PI3K/AKT信号轴可介导血管新生调控。VEGF和VAV2高表达于肝血管生成和转移活跃中的肝癌细胞中，抑制VAV2表达后，肝癌细胞血管形成和转移能力下降[18]。而敲除视网膜细胞中NOX4表达可以减轻病理性视网膜血管生成[19]。本研究结果显示，高糖诱导促进hRECs细胞VEGFR、NOX4、VAV2蛋白的表达，而活血通络方能够抑制这些促进血管形成相关蛋白表达，提示其可能具有抑制视网膜新生血管增殖作用，但其是否通过IncRNA MEG3介导则还需要相关实验进一步明确。
综上所述，活血通络方可通过促进lncRNA MEG3表达抑制高糖诱导hRMECs细胞凋亡损伤及血管生成相关蛋白的表达，并促进细胞增殖。未来将基于IncRNA MEG3表达，进一步深入探究活血通络方对DR的改善作用及机制。
[参考文献][1] ZHENG Y， LEY S H， HU F B. Global aetiology and epidemiology of type 2 diabetes mellitus and its complications[J]. Nat rev Endocrinol， 2018， 14（2）： 88–98.
[12] 梅子寒， 楊杰， 王炜， 等. 基于PI3K/Akt通路探讨脉络宁注射液对早期糖尿病视网膜病变的作用[J]. 中医眼耳鼻喉杂志， 2020， 10（1）： 6–10.
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