冯润滋 杜敏 陈诚 马子玥 周雪平 杨秀玲
摘要 为明确南瓜叶片上卷、黄化的症状是否由病毒侵染引起，本研究采用小RNA深度测序对采集自陕西地区的南瓜叶片样品进行了鉴定。结果显示，侵染南瓜样品的病毒可能是中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus， SLCCNV）。经PCR扩增并且克隆测序获得了病毒的DNA-A和DNA-B组分的全基因组序列。序列比对发现，所克隆的DNA-A组分与SLCCNV海南分离物（SLCCNV-Hn61）DNA-A的一致性最高，为99.1%;DNA-B组分与SLCCNV-Hn61和三亚分离物SLCCNV-SY的DNA-B组分一致性最高，为96.8%。系统进化树分析发现所克隆的DNA-A和DNA-B组分分别与SLCCNV-Hn61和SLCCNV-SY的亲缘关系最近。以上研究结果表明侵染陕西南瓜叶片的病毒是SLCCNV的分离物。这是首次报道SLCCNV在陕西地区的危害，研究结果为当地经济作物南瓜的病害防控提供参考。
关键词 中国南瓜曲叶病毒; 小RNA深度测序; PCR; 基因组序列
中图分类号：
S 436.412.1
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2022008
Abstract To determine whether the leaf curling and yellowing symptoms of pumpkin plants are caused by virus infection， small RNA-based deep sequencing was performed in this study. Analysis of the deep sequencing data indicated that the collected pumpkin plants were potentially infected by squash leaf curl China virus （SLCCNV）. The complete genome sequences of DNA-A and DNA-B components were obtained by PCR amplification， cloning， and sequencing. Sequence comparison showed that the DNA-A component shared the highest sequence identity （99.1%） with the Hainan isolate of SLCCNV （SLCCNV-Hn61）， and the DNA-B component had the highest sequence identity （96.8%） with SLCCNV-Hn61 and the Sanya isolate of SLCCNV （SLCCNV-SY）. Phylogeny analysis showed that the complete genome sequences of DNA-A and DNA-B components were most closely related to the Hainan and Sanya isolates of SLCCNV， respectively. These results suggest that the virus identified in this study is an isolate of SLCCNV. This is the first report of the occurrence of SLCCNV in Shaanxi， China， which provides a reference for the prevention and control of the local pumpkin disease.
Key words squash leaf curl China virus; small RNA deep sequencing; PCR; genome sequence
雙生病毒是世界范围内广泛发生的具有孪生颗粒形态的单链环状DNA病毒，病毒粒子大小为22 nm×38 nm［1］。根据国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）的最新报告，双生病毒有520种，是迄今为止种类最多的植物病毒［1］。基于基因组结构、介体种类以及寄主范围，双生病毒科Geminiviridae被划分为14个属，包括菜豆金色花叶病毒属Begomovirus、玉米线条病毒属Mastrevirus、甜菜曲顶病毒属Curtovirus、番茄伪曲顶病毒属Topocuvirus、伊朗甜菜曲顶病毒属Becurtovirus、芜菁曲顶病毒属Turncurtovirus、弯叶画眉草条纹病毒属Eragrovirus、葡萄红斑病毒属Grablovirus、美杜莎大戟潜隐病毒属Capulavirus、柑橘褪绿矮化相关病毒Citlodavirus、苹果病毒属Maldovirus、桑皱叶病毒属Mulcrilevirus、仙人掌病毒属Opunvirus、番茄顶端曲叶病毒属Topilevirus［2］。其中，菜豆金色花叶病毒属的成员最多，包含了445种病毒，对国内外的番茄、木薯和棉花等作物造成毁灭性危害。根据基因组结构的不同菜豆金色花叶病毒属病毒可以分为2类［3］：一类为双组分双生病毒，其含有大小相近（约2.6 kb）的DNA-A和DNA-B组分;另一类为单组分双生病毒，只含有一个基因组，类似于双组分双生病毒的DNA-A组分，大小约为2.7 kb。很多单组分双生病毒还伴随有大小约为1.3 kb的卫星分子，包括alpha卫星和beta卫星。
中国是世界上最大的南瓜生产国和消费国［4］。南瓜的果实既可以食用也可以药用，是一种具有重要发展前景的作物。近年来，南瓜病毒病发生愈发严重，成为制约南瓜产量的主要因素之一。据报道有80多种病毒能够引起南瓜病害，包括黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus， CMV）、西瓜花叶病毒（watermelon mosaic virus， WMV）、南瓜花叶病毒（squash mosaic virus， SMV）和马铃薯Y病毒（potato virus Y， PVY）等［5］。中国南瓜曲叶病毒（squash leaf curl China virus， SLCCNV）是菜豆金色花叶病毒属的双组分双生病毒，由烟粉虱Bemisia tabaci传播，侵染南瓜、甜瓜和西葫芦等多种葫芦科作物，引起严重的经济损失。SLCCNV于1994年在我国广西南宁的南瓜植株上被首次发现［6］，之后在云南的南瓜［7］、海南的甜瓜［8］等作物中被发现。除此之外，SLCCNV还对菲律宾［9］、印度［10］等地的南瓜、西葫芦等作物造成危害，成为制约葫芦科作物特别是南瓜作物生产的重要因素。
本研究利用小RNA深度测序技术从陕西省表现黄化、叶片卷曲的南瓜样品中鉴定到SLCCNV，并利用PCR等方法获得了SLCCNV DNA-A和DNA-B组分的全长序列和基因组结构。这是首次报道SLCCNV在陕西的危害。
1 材料与方法
1.1 材料来源
2020年9月从陕西省采集到3株具有黄化、叶片卷曲等疑似被病毒侵染症状的南瓜病株（图1），将样品分别编号为SX01、SX02、SX03。
1.2 小RNA深度测序及数据分析
小RNA深度测序在北京诺禾致源生物科技有限公司进行。每个南瓜样品取0.2 g叶片混合后利用TRIzol法提取总RNA并进行文库构建和测序。试验流程主要分为4步：
1）提取样品总RNA并进行质量检测。质量检测主要包括RNA中是否含有杂质，琼脂糖凝胶检测RNA是否被降解;2）将质检合格的RNA用于文库构建;3）对构建的文库进行质量检测并进行HiSeq测序; 4）对小RNA进行拼接，拼接得到的contigs在NCBI中进行BLAST检索。
1.3 植物总DNA的提取
感病南瓜样品的总DNA采用CTAB法提取［11］。用RNAase去除DNA中的RNA并测定浓度后，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，检测合格后保存在-20℃冰箱。
1.4 PCR扩增克隆及序列测定
根据小RNA测序拼接得到的病毒核苷酸序列，设计扩增全长DNA-A的特异性背靠背引物（DNA-A-F：5′-GAACTGGATAAGAACGTGGATATGC-3′; DNA-A-R：5′-AGTTCGAAGGAAAGTTCCAATGCAA-3′）以及扩增DNA-B的特异性背靠背全長引物（DNA-B-F：5′-CGTGTCTCCCTCCGTCAATC-3′;DNA-B-R：5′-ACGAAACAAGCAGA-GTTCACAATTC-3′）。以南瓜样品的总DNA为模板，分别扩增DNA-A和DNA-B组分以获得病毒的全基因组序列。PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，回收目的条带，纯化后连接到pEASY-Blunt Zero克隆载体（北京全式金公司）上，通过热激法转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，将转化后的菌液涂布在含有50 mg/L卡那霉素的LB平板，37℃培养箱中倒置培养12 h。挑取单菌落，以M13F（5′-TGTAAAACGACGGCCAGT-3′）和M13R（5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）为引物，用TaqPCR mix（生工）进行菌落PCR检测，挑选2个阳性单克隆提取质粒，送到北京擎科生物科技有限公司测序。
1.5 病毒DNA-A和DNA-B的序列分析
将测序获得的SLCCNV的DNA-A和DNA-B的全长核苷酸序列在NCBI中进行BLAST检索，用SnapGene软件将获得的序列与已知序列进行比对，并利用ORF Finder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）预测DNA-A和DNA-B的基因组结构。运用SDT软件［12］对得到的南瓜病毒分离物基因组序列与其他SLCCNV不同分离物的基因组序列进行比对。选取已报道的SLCCNV其他分离物的代表性同源序列，利用MEGA 7.0软件［13］对SLCCNV陕西分离物的DNA-A和DNA-B核苷酸全长序列以邻接法构建系统进化树，以泰国番茄黄曲叶病毒tomato yellow leaf curl Thailand virus （TYLCTHV）作为外群，bootstrap设置为1 000。
2 结果与分析
2.1 感病南瓜叶片小RNA高通量测序结果分析
对表现黄化、叶片卷曲的南瓜叶片进行小RNA文库构建并测序，共得到15 086 924条小RNA（raw reads），过滤掉含N量超过10%、质量低、仅含有5′接头和3′接头、没有插入片段以及含有polyA/T/G/C的小RNA后保留了14 910 330条有效小RNA，占总小RNA数的98.83%。小RNA的长度主要集中在18～26 nt，共有8 888 734条，其中主要长度为21 nt，占小RNA总数的19.04%;18、19、20、22 nt和23 nt的小RNA的比例也都超过了10%;24 nt的小RNA占9.75%（图2）。
利用Velvet软件［14］，用参数k-mer 17对18～26 nt的小RNA进行拼接，共得到379条contigs。在NCBI中BLAST搜索发现，与SLCCNV有较高一致性的contigs有29条。其中，比对到SLCCNV DNA-A组分的有13条，覆盖了SLCCNV DNA-A组分的1 277 nt，覆盖比例占全长基因组的46.67%;比对到SLCCNV DNA-B组分的有16条，覆盖了SLCCNV DNA-B组分的1 495 nt，覆盖比例占全长基因组的53.65%。
2.2 DNA-A和DNA-B全长基因组序列的克隆
根据小RNA测序得到的序列，设计了病毒特异性全长引物DNA-A-F/-R和DNA-B-F/-R，以感病南瓜样品的总DNA为模板，利用DNA-A-F/-R引物扩增获得2条全长序列DNA-A-SX01-1和DNA-A-SX02-1;利用DNA-B-F/-R引物扩增共获得1条全长序列DNA-B-SX01-2。将扩增到的条带回收，连接到pEASY-Blunt Zero克隆载体后进行序列测定，测序结果进行BLAST搜索比对，利用SnapGene软件进行拼接，得到2条全长均为2 736 bp的DNA-A组分（登录号：
OM100574）和全长为2 718 bp的DNA-B组分 （登录号：
OM100575）。
对所获得的DNA-A组分的序列进行分析，发现DNA-A-SX01-1和DNA-A-SX02-1的一致性为99.5%。后续以DNA-A-SX01-1为代表进行分析。利用BLAST比对以及SDT软件分析，发现DNA-A-SX01-1与分离自海南地区的SLCCNV（SLCCNV-Hn61）的DNA-A组分的一致性最高，达99.1%，与海南分离物SLCCNV-Hn，云南、广东和广西地区的分离物一致性在95%～99%，与来自其他地区的SLCCNV分离物的一致性都在90%以上;与其他国家的分离物相比，DNA-A-SX01-1与越南和泰国的分离物一致性在95%以上，与印度尼西亚、印度、马来西亚、菲律宾的分离物的一致性在92%～94%之间（表1）。
对DNA-B组分的序列进行分析，发现DNA-B-SX01-2序列与海南分离物SLCCNV-Hn61和三亚分离物SLCCNV-SY的一致性最高，达96.8%;与海南分离物SLCCNV-Hn的一致性为94.7%，与广西和广东分离物的一致性较低，仅分别为87%和86.2%。与其他国家的分离物相比，DNA-B-SX01-2序列与越南分离物SLCCNV-B的一致性较高（达92%），而与印度尼西亚分离物（SLCCNV-Basq-17）、印度分离物（SLCCNV-Pumpkin：Combatore）和泰国分离物（SLCCNV-KN44）DNA-B组分的序列一致性不到90%（表2）。
2.3 DNA-A和DNA-B组分的基因组结构和序列分析
对DNA-A-SX01-1和DNA-B-SX01-2全长序列进行分析，发现DNA-A-SX01-1具有菜豆金色花叶病毒DNA-A组分的典型结构特征，共编码了7个开放阅读框（open reading frames，ORFs），其中病毒链编码AV1（279－1 049 nt）和AV2（41－457 nt），互补链编码AC1（1 507－2 583 nt）、AC2（1 191－1 595 nt）、AC3（1 046－1 456 nt）、AC4（2 250－2 426 nt）、AC5（309－827 nt）。DNA-B-SX01-2共编码2个开放阅读框，病毒链编码BV1（479－1 285 nt），互补链编码BC1（1 338－2 183 nt）。DNA-A和DNA-B在编码链和互补链的非编码区存在一个高度保守的共同区（common region， CR）（图3）。
对DNA-A和DNA-B组分编码的ORF进行分析，发现DNA-A-SX01-1中AV1、AV2、AC1、AC2、AC3、AC4、AC5编码的氨基酸是比较保守的，最为保守的是AV1、AC3和AC4，与其他分离物相应基因一致性都在90%以上，AV2与其他分离物的一致性在74.8%～99.3%之间，AC1与其他分离物的一致性在75.8%～99.4%之间，AC2与其他分离物的一致性在88.2%～100%之间，有的分离物不编码AC5，除了SLCCNV-SY，与其他SLCCNV分离物 DNA-A组分编码的AC5蛋白的氨基酸序列的一致性均在90%以上（表1）。
2.4 DNA-A和DNA-B组分的核苷酸序列的系统进化分析
对获得的陕西分离物的全基因组与世界各地具有代表性的SLCCNV分离物的核苷酸序列进行比对，利用MEGA 7.0软件构建基于全基因组核苷酸序列的系统发育树（图4，5）。从进化树中看出， 根据分离物的地理位置DNA-A组分主要分为4个大支，分别为：来自中国大陆地区、越南和泰国的分离物;来自东帝汶和马来西亚的分离物;来自菲律宾和中国台湾的分离物;来自印度和孟加拉国的分离物。此外，陕西分离物的DNA-A组分与来自中国海南的分离物亲缘关系较近，且与海南分离物SLCCNV-Hn61（AM260205.1）和SLCCNV-Hn（MF062251.1）的亲缘关系最近（图4）。
DNA-B组分的系统进化树（图5）主要分为2个大支：一支包括来自印度、孟加拉国和巴基斯坦的分离物;一支包括来自中国、越南和印度尼西亚的分离物。此外，陕西分离物的DNA-B组分与采集自中国海南的分离物SLCCNV-Hn61（AM260207.1）和SLCCNV-SY（KF99984.1）的亲缘关系较近，其中与SLCCNV-SY的亲缘关系最近。结合序列一致性的分析结果以及国际病毒分类委员会的分类标准，从陕西感病南瓜分离的病毒为SLCCNV的一个分离物，命名为中国南瓜曲叶病毒陕西分离物（squash leaf curl China virus， Shaanxi isolate， SLCCNV-SX-01）。
3 结论与讨论
中國南瓜曲叶病毒（SLCCNV）影响南瓜的产量，其最早于1994年在中国被发现［6］，随后在泰国［15］、菲律宾［9］、印度［10］、巴基斯坦［16］等国家发生危害。目前，SLCCNV在我国海南、云南、广东、广西等省区都有发现［6-8，17］。本研究通过序列分析发现SLCCNV陕西分离物的DNA-A的全长核苷酸序列与SLCCNV-Hn61的一致性最高，DNA-B的全长核苷酸序列与SLCCNV-SY和与SLCCNV-Hn61的一致性最高。根据ICTV的分类标准，双生病毒科菜豆金色花叶病毒属病毒的全基因组核苷酸序列同源性大于91%，则认为是同种病毒，若核苷酸序列一致性介于91%～94%之间，则属于同种病毒的不同株系，大于94%则认为是属于同种病毒的不同分离物［18］。鉴于此，从陕西南瓜样品上分离的病毒确定为SLCCNV的不同分离物。系统进化树分析表明，SLCCNV陕西分离物与我国海南分离物具有最近的亲缘关系，且采集自不同地区的SLCCNV分离物DNA-A和DNA-B组分呈现明显的地理区域分布。
AV1编码双生病毒的外壳蛋白，其序列一般是保守的。在用DNA-A的核苷酸进行一致性比对中发现，DNA-A-SX01-1与SLCCNV-Hn61的一致性为99.1%，而用AV1编码的氨基酸序列进行一致性比对时，二者的一致性只有95.7%，在所有比较序列中一致性是最低的。进一步分析DNA-A-SX01-1和SLCCNV-Hn61的核苷酸和氨基酸序列，发现DNA-A-SX01-1的AV1第740 nt存在一个碱基的缺失导致了密码子的移码，使AV1的第247位脯氨酸变成了精氨酸，同时也使后面的氨基酸发生了变化，最终使终止密码子的出现延后。这些变化使DNA-A-SX01-1与SLCCNV-Hn61的AV1之间的氨基酸一致性相对较低。
SLCCNV可以危害多种葫芦科作物，造成植株矮化和曲叶［8］。SLCCNV可以通过烟粉虱传播，因此在烟粉虱高发的季节，SLCCNV造成的病害可能会更严重，可以采用治虫防病的方法来防控病害的发生［19］。我国地缘辽阔，蔬菜种类众多，SLCCNV除了侵染南瓜外，还侵染甜瓜、西葫芦、冬瓜等葫芦科作物［8，10，20］，甚至在多年生茄科杂草上也有发现［21］，说明SLCCNV的宿主范围较大，需要加强作物SLCCNV的检测来应对其潜在的威胁，阻止病毒的传播扩散。
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（责任编辑：杨明丽）