蔡 霈，乐伊婕，邱叶贝，郑 艺，李 慧，曹建国，李 程，佘志华
（1.湖南省妇幼保健院，长沙 410008；
2. 湖南师范大学医学院，长沙 410006）
MicroRNA-34a（miR-34a）是一种内源性小非编码单链RNA，亦是一种重要的肿瘤抑制性miRNA［1］。miR-34a 在正常组织中高表达；
而在各种类型肿瘤，如肝细胞癌和胰腺癌中通常表观遗传沉默［2，3］。miR-34a能直接靶向抑制多种在恶性肿瘤发生和发展中起重要作用的致癌性转录因子、信号分子和CSC 标志物，包括CD44 和Notch-1 等［4，5］。本文旨在探讨miR-34a-5p 对三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞Notch1 表达和紫杉醇敏感性的影响。
1.1 细胞培养 人乳腺上皮细胞MCF-10A、人乳腺癌MDA-MB-231 细胞系购自中国科学院细胞库（中国上海）；
用含10%胎牛血清（FBS）、100 IU/mL 青霉素和 100μg/mL 链霉素的DMEM 培养基培养。置于含5%CO2培养箱中37℃培养。
1.2 实时荧光定量PCR 以TRIzol 试剂（美国，Life Technologies）提取MCF-10A、MDA-MB-231 细胞总RNA，按照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis 试剂盒说明书操作将其逆转录合成为cDNA。以TaqMan实时荧光定量PCR（美国，Applied Biosystems）进行qRT-PCR 测定，2-△△Ct方法分析测定结果。miR-34a-5p 引物（广州锐博生物科技公司）：F：5"-CGG TAT CAT TTG GCA GTG TCT-3"；
R：5"-GTG CAG GGT CCG AGG T-3"。Notch1 引物（上海生工生物工程公司）：F：5"GGTGAGACCTGCCTGAATG"，R：5"GTTGGGGTCCTGGCATC 3"。
1.3 miR-34a mimic 瞬时转染 miR-34a mimic（货号：miR10004557-1-5）由广州锐博生物科技公司提供。以Lipofectamine2000 质粒转染系统将miR-34a mimic 转染MDA-MB-231 细胞 24h。使用TRIzol 试剂（Invitrogen）从转染后的MDA-MB-231 细胞中提取总RNA，以定量PCR 技术检测miR-34a-5p 与Notch1 表达水平。
1.4 Western blot 检验 按前述发表文献所述［6］，以RIPA 裂解缓冲液（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA）于冰浴中裂解所收集的上述细胞30min，BCA 试剂盒（Pierce，Rockford，IL）测定蛋白浓度，每个样品等量（40μg）以10% SDS-PAGE 分离后电转至PVDF膜，5% BSA 室温封闭1h，一抗β-actin（Santa Cruz Biotechnology，Inc，CA，USA，货号：sc-7210）、Notch1（Cell Signaling Technology，Inc. Danvers，MA，USA，货号：#3608）4℃孵育过夜。TBST 洗净后以辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG 二抗室温孵育1 h，ECL 试剂检测蛋白条带，化学发光系统（美国，Amersham Pharmacia Biotehc）拍照，以Image J 软件计算灰度值。
1.5 CCK-8 法检测细胞存活力 取对数生长期的MDA-MB-231 细胞（miR-34a mimic 转染/乱序阴性对照）接种于96 孔培养板中，4000 个/每孔。待细胞贴壁完全，分别加入不同浓度紫杉醇（终浓度为0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 nM），72h 后移除培养基，每孔加入100μL含有10μL CCK-8 试剂（日本Dojindo 公司）的DMEM 培养基（1：9），孵育2h 后，用酶标仪于450nm 波长处测定吸光度值（A）并计算紫杉醇IC50值。
1.6 统计学分析 数据采用SPSS 23.0 进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，与对照组的两两比较采用LSD-t 检验分析。P<0.05 认为差异具有统计学意义。
2.1 MDA-MB-231 细胞低表达miR-34a-5p 为了确定miR-34a 表达水平是否与细胞异常增殖活性有关，我们评估了miR-34a-5p 在人乳腺细胞MCF-10A与三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞中的表达水平。结果表明人乳腺上皮细胞MCF-10A 中的miR-34a-5p表达水平远高于人乳腺癌MDA-MB-231 细胞（图1，P<0.05）。
图1 qRT-PCR测定miR-34a-5p表达水平（mean±SD，n=3）与MCF-10A细胞比较，P<0.05。
2.2 miR-34a-5p 降低Notch1 mRNA 水平 为了确定miR-34a 对于Notch1 mRNA 表达的影响，我们采用miR-34a mimic 瞬时转染MDA-MB-231 细胞，同时以qRT-PCR 检测Notch1 mRNA 表达水平。图2 表明，与培养基处理或乱序阴性对照转染的MDA-MB-231 细胞相比，转染miR-34a mimic 后的MDA-MB-231 细胞中Notch1 mRNA 表达水平显著下降（P<0.05）。
图2 qRT-PCR测定Notch1 mRNA表达水平（mean±SD，n=3）与亲本MDA-MB-231细胞比较，*P<0.01 ；
与乱序阴性对照寡核苷酸（miR-NC）转染MDA-MB-231细胞比较，#P<0.05
2.3 miR-34a-5p 下调Notch1 蛋白表达 收集经miR-34a mimic 瞬时转染的MDA-MB-231 细胞，提取蛋白后以western blot 分析Notch1 蛋白表达水平。如图3 所示，与培养基处理或乱序阴性对照处理的MDA-MB-231 细胞相比，转染miR-34a mimic 后的MDA-MB-231 细胞中Notch1 蛋白表达水平显著下降（P<0.05）。
图3 蛋白质免疫印迹分析Notch1蛋白表达水平（mean±SD，n=3）与亲本MDA-MB-231细胞比较，*P<0.01 ；
与乱序阴性对照寡核苷酸（miR-NC）转染MDA-MB-231细胞比较，#P<0.05
2.4 miR-34a-5p 增强MDA-MB-231 细胞对紫杉醇的敏感性 CCK-8 试剂盒测定紫杉醇抑制MDAMB-231 或经miR-34a-5p 转染的MDA-MB-231 细胞存活力的IC50值。结果如图4 所示，与培养基处理或乱序阴性对照处理的MDA-MB-231 相比，紫杉醇在转染miR-34a mimic 后的MDA-MB-231 细胞的IC50值显著下降（P<0.05）。
图4 紫杉醇抑制MDA-MB-231细胞存活力IC50值（mean±SD，n=3）与亲本MDA-MB-231细胞比较，*P<0.01 ；
与乱序阴性对照寡核苷酸（miR-NC）转染MDA-MB-231细胞比较，#P<0.05
本研究的实验结果表明：三阴性乳腺癌细胞MDAMB-231 中miR-34a-5p 表达水平远低于人乳腺细胞MCF-10A，提示：miR-34a-5p 在肿瘤细胞中表观遗传沉默；
通过转染外源性miR-34a mimic 增加MDAMB-231 细胞中miR-34a-5p 表达，能够使Notch1 mRNA 与蛋白表达水平降低，而紫杉醇在敲低Notch1表达的MDA-MB-231 细胞IC50值下降。提示：miR-34a 能够通过调控Notch1 表达从而影响肿瘤细胞对于紫杉醇的敏感性。
许多研究证明，miR-34a 作为一种重要的肿瘤抑制性miRNA，能够直接靶向抑制多种恶性肿瘤发生和发展中的致癌性相关因子。miR-34a 能够抑制乳腺癌细胞增殖，同时能够抑制乳腺癌细胞迁移与侵袭［7，8］。Notch1 信号通路与乳腺癌发生、耐药密切相关，Notch1异常表达是乳腺癌预后不良的标志［9］。Notch1 作为一种干细胞基因，还参与乳腺癌干细胞的维持和自我更新，同时影响ABC 转运蛋白（如P-gp）与抗凋亡蛋白Bcl-2 家族成员表达，这些相关蛋白表达变化与肿瘤细胞的多药耐药、复发、侵袭和转移密切相关［10，11］。本文证实miR-34a-5p 负性调控三阴性乳腺癌MDAMB-231 细胞的靶基因Notch1 表达；
过表达miR-34a-5p 能抑制Notch1 转录和蛋白表达从而增强紫杉醇对三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞存活力抑制作用，这些结果为以miR-34a/Notch1 轴作为肿瘤治疗靶标及临床疗效预测标志物提供了实验证据。
总而言之，本文的研究证实miR-34a-5p 调节三阴性乳腺癌MDA-MB-231 细胞Notch1 表达从而增强化疗药物细胞毒作用，为miR-34a/Notch1 轴作为耐药乳腺癌早期诊断标志物与肿瘤治疗过程中的关键靶标提供了实验依据，并揭示了miR-34a-5p 负性调控Nocht1转录的分子机制。
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