刘江红,苏会敏,薛 健
(1.东北石油大学 化学化工学院,黑龙江 大庆 163318;2.黑龙江省环境科学研究院,黑龙江 哈尔滨 150076;3.哈尔滨泽能环保科技有限公司,黑龙江 哈尔滨 150000)
20世纪60年代微生物固定化技术应运而生[1],微生物固定化技术是通过物理和化学的方法将游离的细菌、真菌、酶或细胞等限制在固定区域内,单位体积内的微生物浓度随之得到提高,微生物的活性得到了保证[2-3]。大豆分离蛋白是指低温脱脂豆粨离心分离后得到的蛋白质,大豆分离蛋白的蛋白质含量高,价格低廉,具有很多优良性能,若不加以利用,将会造成极大的浪费[4-5]。Molina Ortiz等[6]探究大豆分离蛋白以2种不同比例包埋酪蛋白水解物,并且通过粒径大小、溶解性、疏水性、热力学性质等研究考察包埋效果。Xiao J X等[7]探究不同因素对大豆分离蛋白-阿拉伯胶复合物包埋甜橙油的影响,在m(大豆分离蛋白)∶m(阿拉伯胶)＝1∶1,p H＝4的条件下,大豆分离蛋白-阿拉伯胶复合物制成的微胶囊对甜橙油的包埋效果最好。张英华等[8]通过实验探究在CaCl2存在的条件下,利用大豆分离蛋白形成的冷凝胶包裹乳酸菌,与游离的细菌相比,具有较强的抗酸作用。此外张英华等[9]的另一项实验研究,葡萄糖酸内酯诱导大豆分离蛋白冷凝胶在胃酸p H环境下对乳酸菌的保护作用,再一次证明了大豆分离蛋白冷凝胶包裹下的细菌,具有抵抗不利环境条件的能力。
1.1 原料、试剂与仪器
菌种:从染料废水样品中分离、筛选、纯化,并在实验室保存。
亚甲基蓝:天津博迪化工股份有限公司;氯化钙:天津市耀华化工厂;蔗糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铵、磷酸二氢钾:天津市塘沽鹏达化工厂;海藻酸钠:天津市凯通化学试剂有限公司;以上试剂均为分析纯;大豆分离蛋白:生物试剂,上海楷洋生物技术有限公司。
电热恒温培养箱:SYQ-DSX-280B,南京晓晓仪器设备有限公司;台式恒温振荡培养箱:HZQX100,常州恒隆仪器有限公司;p H计:p HS-3C,济南光耀医疗设备有限公司;可见分光光度计:722E,北京瑞青橙仪器仪表有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 培养基的处理
染料降解培养基(MSM):(NH4)2SO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,CaCl2·2H2O 0.01 g,KH2PO41.5 g,K2HPO41.0 g,FeSO4·7 H2O 0.01 g,蔗糖10 g,蒸馏水1 000 m L,p H＝7.0,t＝121℃高压蒸汽灭菌25 min。
1.2.2 大豆分离蛋白-海藻酸钠微胶囊的制备
1.2.2.1 大豆分离蛋白溶液和海藻酸钠溶液的电位测量
使用Zeta电位仪测量p H＝3~7的大豆分离蛋白溶液和海藻酸钠溶液(两者质量浓度相同)的电位值,每个样品需重复测量3次,取平均值。
1.2.2.2 大豆分离蛋白-海藻酸钠储备溶液的制备
分别配置10 g/L的大豆分离蛋白和海藻酸钠溶液,其中海藻酸钠需要加热溶解,将配置好的2种溶液放置于4℃冰箱中24 h,然后制备1 mol/L的CaCl2溶液。
1.2.2.3 大豆分离蛋白-海藻酸钠微胶囊固定化青霉菌
取φ(青霉菌孢子)＝1%悬液10 m L,加入ρ(大豆分离蛋白)＝10 g/L和ρ(海藻酸钠)＝10 g/L溶液,使V(青霉菌孢子悬液)∶V(大豆分离蛋白)∶V(海藻酸钠)＝1∶5∶1、1∶4∶1、1∶3∶1、1∶2∶1、1∶1∶1、1∶1∶2、1∶1∶3、1∶1∶4、1∶1∶5。使用10 m L的一次性无菌注射器分别将上述不同比例的混合溶液缓慢滴加至装有c(CaCl2)＝1 mol/L溶液的50 m L烧杯中,置于4℃冰箱内固化24 h,形成大豆分离蛋白-海藻酸钠固定化微胶囊,用生理盐水洗涤3次后浸泡,于4℃冰箱保存,备用,方便后续实验的使用。
1.2.3 扫描电镜观察
(1)将实验得到大豆分离蛋白-海藻酸钠微胶囊用生理盐水洗净,加入w(戊二醛)＝2.5%、p H＝6.8的溶液固定,于冰箱中保存12 h。(2)将戊二醛固定后的样品用生理盐水冲洗2次。(3)分别用φ(乙醇)＝50%、70%、80%、90%、100%溶液对样品进行脱水,每次10 min。(4)用φ(叔丁醇)＝50%、70%、80%、90%、100%溶液(由乙醇溶液配置)对样品进行置换各10 min。(5)用临界点干燥仪对样品进行干燥后,将样品观察面向上粘贴在扫描电镜样品台上,在其表面镀一层金属膜,将预处理好的样品进行扫描电镜观察。
1.2.4 固定化青霉菌微胶囊脱色亚甲基蓝的机理探究实验
选取4个250 m L锥形瓶,分别标记1、2、3和4号,分别加入100 m L染料降解培养基和2 m Lρ(亚甲基蓝)＝1 g/L母液,使最终ρ(亚甲基蓝)＝20 mg/L,分别进行以下几种实验操作。(1)在1号瓶内加入大豆分离蛋白粉末5 g,间隔12 h测定吸光度值,计算脱色效率。(2)在2号瓶内加入海藻酸钠粉末5 g,间隔12 h测定吸光度值,计算脱色效率。(3)在3号瓶内加入未包裹青霉菌孢子的大豆分离蛋白-海藻酸钠微胶囊样品5 g,间隔12 h测定吸光度值,计算脱色效率。(4)在4号瓶内加入完好的包裹青霉菌孢子的大豆分离蛋白-海藻酸钠微胶囊样品,间隔12 h测定吸光度值,计算脱色效率。将上述4瓶溶液置于n＝120 r/min、t＝35℃振荡培养箱内恒温培养,最后对比4瓶亚甲基蓝的脱色效率。
1.2.5 不同因素对亚甲基蓝脱色效率的影响
考察固定化青霉菌微胶囊脱色亚甲基蓝过程中各因素对亚甲基蓝脱色效率的影响。亚甲基蓝的脱色实验在初始ρ(亚甲基蓝)、p H值(通过滴加0.1 mol/L HCl或Na OH溶液进行调节)、固定化微胶囊添加量和时间等不同条件下进行。
2.1 固定化青霉菌微胶囊的性能探究
2.1.1 大豆分离蛋白溶液和海藻酸钠溶液的电位测量
大豆分离蛋白溶液和海藻酸钠溶液的电位值随p H值的变化见图1。
图1 大豆分离蛋白溶液和海藻酸钠溶液的电位值随pH值的变化
由图1可知,p H＝3,大豆分离蛋白溶液和海藻酸钠的电位差值最大为87.9 m V,2种溶液混合,因电位差值相差较大,会迅速聚合发生反应,形成聚合物,更加有利于固定化微胶囊的合成及稳定性,因此选择p H＝3进行后续实验[10-11]。
V(大豆分离蛋白)∶V(海藻酸钠)＝1∶1形成的固定化微胶囊的宏观图见图2。
图2 固定化微胶囊的宏观图
由图2可知,V(大豆分离蛋白)∶V(海藻酸钠)＝1∶1形成的微胶囊直径适中、大小均一,基本没有拖尾情况,由此方法制备的微胶囊,浸泡于生理盐水中,放置于4℃的冰箱里,保存超过3个月形态没有变化,可继续用于实验使用。
2.1.2 固定化青霉菌微胶囊的扫描电镜观察
固定化青霉菌微胶囊的扫描电镜图见图3。
图3 固定化青霉菌微胶囊的扫描电镜图
由图3a和图3b可知,微胶囊表面致密,致密结构可以防止外界环境不利因素入侵,保护内部包裹的青霉菌孢子。图3c是微胶囊切开后的横切面的扫描电镜图,将切面部分放大100倍后得到图3d,由图3d可知,微胶囊具有多孔结构,内部的青霉菌孢子可以通过这些孔道吸收培养基内的营养物质,供青霉菌的生长,同时亚甲基蓝染料也可以通过这些孔道进入微胶囊内部。这种疏松多孔结构具有很好的吸附作用,可以有效提高亚甲基蓝的脱色效率。
2.2 固定化青霉菌微胶囊机理探究
固定化青霉菌微胶囊机理的实验探究见图4。
图4 固定化青霉菌微胶囊机理的实验探究
由图4可知,t＞24 h,甲基蓝的脱色率1号瓶仅为4.01%;2号瓶仅为1.71%,可见大豆分离蛋白和海藻酸钠2种固定化材料对亚甲基蓝的脱色作用较 小;3号 瓶为34.98%,4号 瓶 为94.21%。t＞48 h,亚甲基蓝的脱色率为97.02%,由此可知大豆分离蛋白-海藻酸钠微胶囊结构和青霉菌对亚甲基蓝具有吸附作用。
2.3 不同因素对亚甲基蓝脱色效率的影响
不同因素对亚甲基蓝脱色率的影响见图5。由图5a可知,青霉菌经过微胶囊固定化后,ρ(亚甲基蓝)＝20 mg/L,脱色率达到98.01%;由图5b可知,青霉菌经过微胶囊固定后,亚甲基蓝的脱色率先增加后降低;由图5c可知,固定化青霉菌添加量为3.0 g,亚甲基蓝的脱色率达到94.59%;由图5d可知,青霉菌经过微胶囊固定后,随着时间的增加,亚甲基蓝脱色率迅速增加,在达到最大效率后,脱色率逐渐趋于稳定。固定化后的青霉菌与固定前的游离菌相比,显著提高了对亚甲基蓝的脱色率。
图5 不同因素对亚甲基蓝脱色效率的影响
(1)以大豆分离蛋白和海藻酸钠作为固定化材料固定青霉菌,使用Zeta电位仪进行电位分析,通过性能测试确定最佳合成条件为m(大豆分离蛋白)∶m(海藻酸钠微胶囊)＝1∶1,p H＝3。通过透射电镜探究大豆分离蛋白-海藻酸钠微胶囊,可观察到疏松多孔结构,该结构有助于后续实验过程中对亚甲基蓝的脱色;
(2)由机理探究部分的实验数据可知,大豆分离蛋白和海藻酸钠单一的固定化材料对亚甲基蓝的脱色率很低,固定化后亚甲基蓝的脱色主要是固定化结构和青霉菌的吸附作用导致;
(3)考察不同因素对固定化青霉菌的影响可知,固定化青霉菌后,可以有效抵抗强酸强碱、高质量浓度亚甲基蓝等不利因素的影响。
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