王晓英，裴妙荣，赵艳艳
（1.山西中医药大学，山西 晋中 030619；
2.桂林医学院，广西 桂林 541199）
脑震荡是常见的轻型颅脑损伤类型，有头痛、头晕及程度不一的植物神经功能失调（耳鸣、心悸、血压波动、多汗、性功能下降等）、注意力涣散、记忆力减退、情绪不稳容易激动等表现，以伤后即刻出现定向障碍或者意识障碍，伤后24 h内出现平衡功能缺失，伤后48 h内出现反应迟钝及学习能力和记忆力减退为其主要症状［1］。脑震宁颗粒由活血祛瘀药队：（当归、川芎、牡丹皮、丹参、地黄、地龙）、除烦止呕药队：（陈皮、竹茹）、安神益智药队（柏子仁、酸枣仁、茯苓）共11味中药经科学提取加工制成，共奏凉血活血、化瘀通络、益血安神、宁心定智、除烦止呕之效。临床使用脑震宁颗粒治疗脑震荡效果颇佳，我们对该方进行拆方，应用于脑震荡模型小鼠，观察各组动物空间学习记忆能力的变化，从而探求脑震宁颗粒组方的科学意义。
1.1 实验材料
1.1.1 动物与仪器 4周龄ICR小鼠，雄性，体质量（18～22）g，购自山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（晋）2015-0001。自制小鼠脑震荡制造仪；
Morris水迷宫（BW-MWM101，上海软隆科技发展有限公司）。
1.1.2 药物与试剂 脑震宁颗粒（山西振东安特生物制药有限公司出品，批号：Z14021119，10 g/袋）；
0.9%氯化钠注射液（山东华鲁制药有限公司，250 mL，2.25 g/瓶，批号：C07020410）；
当归、川芎、茯苓、酸枣仁（炒）、地黄、地龙、陈皮、柏子仁、牡丹皮、竹茹、丹参由山西振东安特生物制药有限公司提供，与脑震宁颗粒（批号：Z14021119）原料一致，经裴香萍教授鉴定为合格品。
1.2 方 法
1.2.1 给药样品制备 脑震宁颗粒全方：脑震宁颗粒加蒸馏水配置成0.85 g/mL的灌胃液。脑震宁去酸枣仁、柏子仁、茯苓（实验1组）：全方去酸枣仁、柏子仁、茯苓，按脑震宁颗粒制备方法制备颗粒剂，配置成0.59 g/mL的灌胃液。脑震宁去酸枣仁（实验2组）：全方去酸枣仁，按脑震宁颗粒制备方法制备颗粒剂，配置成0.76 g/mL的灌胃液。脑震宁去柏子仁（实验3组）：全方去柏子仁，按脑震宁颗粒制备方法制备颗粒剂，配置成0.76 g/mL的灌胃液。
1.2.2 造模、分组、给药 根据参考文献［2］，自制小鼠脑震荡制造仪，采用振动法造模：将单只小鼠放入铁盒内，以10次/min左右的频率用力摇晃，使小鼠撞击盒子内壁造成脑震荡。造模后观察并记录小鼠恢复自主呼吸及意识障碍等各种反射的时间，同时观察造模后30 min内小鼠呼吸及运动能力等的变化。造模成功的标准：①短暂的意识障碍，30 min内恢复；
②短暂的呼吸暂停或减弱，20 s内恢复；
③短暂的角膜反射、痛刺激反射，3 min内恢复；
④无遗留运动功能障碍；
⑤肉眼及组织学观察均无脑挫伤灶［2］。50只造模成功的小鼠纳入实验，随机分为5组，每组10只，分别为模型组、全方组、实验1组、实验2组、实验3组。空白组10只不造模。各给药组按体重分别灌胃制备好的对应药液，灌胃量为0.2 mL/10 g，空白组和模型组予等体积生理盐水，每日1次，连续6 d。
1.2.3 Morris水迷宫测试 Morris水迷宫由圆形水池、可移动位置并隐藏在水下面的平台、图像自动采集处理系统组成。水迷宫直径100 cm，水深21 cm，水池内壁已做黑色喷塑处理；
平台直径9 cm，表面粗糙，内壁高度20 cm，肉眼观察水面无法看清平台位置，水温21～22℃。采用Morris水迷宫定位航行和空间探索实验检测小鼠学习记忆和记忆保持能力。给药6 d，第1天到第5天为有平台测试，第6天为撤去平台的测试，均于每天给药1 h后进行。
定位航行实验：实验第1天到第5天，将小鼠放入水池中（不放平台）自由游泳2 min，使其熟悉迷宫环境。训练开始时，将平台置于第III象限，将小鼠由第I象限面向池壁放入水池。自由录像记录系统记录小鼠找到目标平台所需的时间和游泳距离，小鼠找到平台后或60 s内找不到平台（潜伏期记为60 s）由实验者将其拿上平台，在平台上体息15 s，吹干后放回笼中。
空间探索实验：实验第6天，撤除水下平台，随机选定一个入水点将小鼠均于此处面向池壁放入水中，记录小鼠在60 s内第1次跨越平台时间和穿越平台的次数。图像自动监视和处理系统自动完成数据采集及图像分析数据。
1.3 统计学处理
所有统计分析均采用SPSS12.0统计软件进行，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间数据比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 定位航行实验
模型组小鼠平均速度、在目标象限第Ⅲ象限的路程与停留时间均较空白组降低（P＜0.05）。上述指标全方组、实验2组、实验3组与空白组比较差异无统计学意义，而明显高于模型组（P＜0.05，P＜0.01），其中以全方组最高。实验1组的平均速度及在目标象限第Ⅲ象限的路程与空白组接近，在第Ⅲ象限的时间与模型组接近，但差异均无统计学意义。结果见表1。
表1 定位航行实验结果 （±s）
表1 定位航行实验结果 （±s）
注:与空白组比较，1）P＜0.05；
与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01
组别平均速度（mm/s）第Ⅰ象限路程（mm）第Ⅱ象限路程（mm）第Ⅲ象限路程（mm）第Ⅲ象限时间（s）空白组229.17±39.072）3406.30±1326.09 1751.41±479.24 2651.05±763.842）15.92±4.552）模型组187.01±37.911）3579.33±1018.60 2904.41±1497.93 2032.65±327.181）10.28±4.931）全方组238.91±30.223）4356.89±1572.63 2809.36±991.21 2719.65±810.272）11.66±4.94实验1组227.84±41.83 3097.35±1503.51 2946.79±1490.56 2695.99±817.38 11.78±4.33实验2组226.07±15.423）3421.64±1320.89 2601.72±1006.82 2665.85±1572.662）11.58±7.15实验3组240.67±26.173）3723.15±747.86 2976.69±1335.17 2669.97+768.612）12.21±3.162）
2.2 空间探索实验
模型组小鼠平均速度、在目标象限第Ⅲ象限的路程与停留时间、站台穿越次数均明显低于空白组。全方组、实验2组上述指标均较模型组明显增加（P＜0.05，P＜0.01）；
实验1组站台穿越次数高于模型组（P＜0.05）；
实验3组小鼠平均速度以及在目标象限第Ⅲ象限的路程与停留时间均较模型组增加（P＜0.05）。各给药组小鼠上述指标与空白组比较，差异均无统计学意义。结果见表2。
表2 空间探索实验结果 （±s）
表2 空间探索实验结果 （±s）
注:与空白组比较，1）P＜0.05；
与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01
组别平均速度（mm/s）第Ⅲ象限路程（mm）第Ⅲ象限时间（s）站台穿越次数（次）空白组249.49±45.142）4294.2210±928.09 13.74±6.992）1.80±0.632）模型组197.22±44.781）2982.8256±1250.84 14.99±4.401）1.21±0.921）全方组247.78±15.373）4556.4033±992.82 23.09±5.883）2.51±0.713）实验1组248.53±29.29 3471.1071±1067.24 17.64±5.56 1.92±1.29实验2组214.94±18.792）3908.3840±566.75 19.55±3.072）2.30±1.162）实验3组238.38±43.852）4131.3522±1034.90 19.66±3.062）1.51±0.53
上述结果表明振动法对小鼠造成的空间记忆、工作记忆以及空间辨别能力的损伤明显，脑震宁全方及其安神药队均能提高小鼠空间记忆、工作记忆以及空间辨别能力。
Morris水迷宫由英国心理学家Morris设计，并用于学习记忆脑机制的研究［3-4］，是目前国际通用的较好的空间辨别学习工具。脑损伤动物在迷宫中找到隐匿平台的时间越长，表明其认知记忆缺失越明显；
在空间探索实验中，如果动物有良好正常的学习记忆能力，则动物在原平台所在区域就会停留较长的时间，所以我们利用Morris水迷宫实验研究脑震宁颗粒对脑震荡小鼠模型的益智作用。
脑震宁颗粒中酸枣仁、柏子仁、茯苓皆为安神类药物，而安神类药物对记忆有一定的影响，可以增加GABA（γ-氨基丁酸）含量，对大鼠神经功能缺失症状有一定改善，具有脑保护作用［5-7］。酸枣仁为鼠李科植物酸枣（Ziziphus jujubeMill.）的干燥成熟种子［5-7］，具有宁心、安神等功效，用于治疗虚烦不眠、惊悸多梦等症。黄酮类成分是酸枣仁的主要活性成分之一［2］，除镇静催眠外，还具有抗焦虑、抗抑郁、增强记忆力、脑神经保护、抗氧化等多种作用。柏子仁为柏科植物侧柏［Platycladus orientalis（L.）Franco］的种仁，其性平味甘，入心、肝、肾、大肠经，具有宁心安神、敛汗生津、润肠通便之功效［3-4］。茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾宁心等作用，临床用于水肿、心悸、失眠等。茯苓能改善苯巴比妥钠所致记忆障碍小鼠的学习记忆能力，具有明显镇静催眠作用［8］。各给药组益智作用由强到弱顺序为：脑震宁全方组＞实验3组（全方去柏子仁）＞实验2组（全方去酸枣仁）＞实验1组（全方去酸枣仁、柏子仁和茯苓）。由此可以推测脑震宁颗粒中酸枣仁、柏子仁、茯苓为改善小鼠脑震荡后记忆损伤的主要成分，其他药味也可发挥协同作用，而以全方组疗效最佳。酸枣仁、柏子仁、茯苓等安神药队及脑震宁颗粒对学习记忆影响的机制，有待深入研究。
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