刘建新 刘瑞瑞 刘秀丽 欧晓彬 贾海燕 卜 婷 李 娜
（甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室/陇东学院生命科学与技术学院，庆阳 745000）
土壤盐渍化是制约农业可持续发展的全球性生态问题［1］。我国内陆地区的盐碱地主要为中性盐（NaCl、Na2SO4）和碱性盐（NaHCO3、Na2CO3）伴生构成的复合类型，对植物产生盐碱复合胁迫［2］。因中性盐胁迫（简称盐胁迫）和碱性盐胁迫（简称碱胁迫）间存在协同效应，故盐碱复合胁迫对植物的伤害常大于单一盐胁迫或碱胁迫［3］。然而，已有的植物抗盐碱机制研究主要集中在NaCl单盐胁迫方面，对盐碱复合胁迫的研究涉及较少。盐碱复合胁迫下，渗透胁迫、营养失衡和高pH 叠加［4］，因而维持细胞渗透调节、电荷平衡及pH 稳定对植物适应盐碱环境尤为关键［5］。有机酸是一类含有羧基的低分子量化合物，也是物质和能量代谢的中间产物，它在植物响应盐碱胁迫中发挥着重要作用［6］。研究表明，盐胁迫引起苋（Amaranthus tricolor）根部和地上部有机酸积累［7］；
盐、碱胁迫诱导番茄（Lycopersicon esculentum）根系有机酸水平提高［8］；
而茎叶积累有机酸和根系主要分泌柠檬酸是盐生植物星星草（Puccinellia tenuiflora）响应碱胁迫的重要机制［9］。盐胁迫还造成甜菜（Beta vulgaris）叶片有机酸组成发生改变［10］；
盐、碱胁迫引起碱地肤（Kochia scopariavar.sieversiana）不同有机酸主要在茎叶特别是成熟叶片中分布［11］。总之，盐碱胁迫下植物有机酸代谢积累是极为复杂的过程，其含量高低受植物遗传特性和环境胁迫等因素的共同作用。植物激素调控有机酸代谢酶的活性，在调节有机酸在植物不同组织中的分配和积累过程中发挥着重要作用［12］。因此，研究有机酸和内源激素对盐碱胁迫的响应及其调控措施对揭示植物抗盐碱机理和增强抗盐碱性具有重要理论和实践意义。
研究表明，内源激素对植物适应盐碱胁迫具有重要调节作用。如张敏等［13］发现，盐胁迫下小麦（Triticum aestivum）根系和叶片中生长素（indole-3-acetic acid，IAA）和赤霉素（gibberellins，GAs）含量下降，脱落酸（abscisic acid，ABA）和玉米素核苷（zeatin riboside，ZR）含量升高，IAA/ABA 和GA3/ABA 比值降低。Tuna 等［14］研究表明，高盐胁迫使玉米（Zea mays）中乙烯和ABA 含量升高，而IAA、GAs 和细胞分裂素（cytokinin，CTK）含量下降。王鑫等［15］研究显示，甜菜遭受盐碱胁迫后叶片IAA、GAs 和ABA 含 量 提 高，而CTK 含 量 下 降。Zhang等［16］指出，植物受到轻度盐胁迫时体内GAs 含量升高，从而降低叶片气孔阻力，加速蒸腾作用和提高水分利用效率。Cachorro等［17］证明，盐胁迫下菜豆（Phaseolus vulgaris）体内ABA 含量的升高降低叶片气孔导度，从而减少水分蒸腾并降低盐离子伤害。Formentin 等［18］研究认为，激素代谢的快速调节通过诱导特异的形态生理反应促进水稻（Oryza sativa）耐盐性提高。迄今，已有许多研究探讨盐、碱胁迫下植物体内有机酸和激素含量的变化，然而外源信号提高植物盐碱耐性的有机酸和内源激素响应机制目前尚知之甚少。
硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是植物体中继一氧化氮和一氧化碳之后发现的第3种气体信号，它参与植物许多生理过程的调控，能够增强植物对非生物胁迫的抗性［19］。研究表明，盐胁迫下，H2S能维持水稻矿质离子平衡［20］，提高大麦（Hordeum vulgare）的钾钠比［21］，增强茶树（Camellia sinensis）［22］和玉米［23］抗氧化防御能力。盐碱复合胁迫下，外源H2S 参与裸燕麦（Avena nuda）渗透胁迫调节［4］，且抽穗期喷施50 μmol·L-1H2S 供体NaHS 溶液缓解盐碱复合胁迫对裸燕麦伤害的效果最佳［24］。裸燕麦是一种禾本科（Poaceae）燕麦属（Avena）西北特色优势作物，其籽粒富含β-葡聚糖和燕麦黄酮等降低血清胆固醇的成分，是美国食品和药物管理局批准的第1 个“具有降低心脏病风险”的谷物保健食品［25］。甘肃省是我国西部裸燕麦的主要种植地之一，裸燕麦也是当地农民增收和改善膳食结构的重要杂粮，但土壤盐碱化严重制约裸燕麦的生长发育和产量提高。本试验模拟甘肃省裸燕麦种植地盐碱含量和组成，采用盆栽土培试验，研究喷施NaHS对盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片有机酸和激素水平的调控以及对产量性状的影响，以期揭示H2S增强植物耐盐碱性的生理机制，为探索利用H2S缓解裸燕麦盐碱胁迫提供理论依据。
1.1 供试材料与材料培养
试验于2021 年4—8 月在甘肃省陇东生物资源保护利用与生态修复重点实验室生物科技园进行。供试土壤取自陇东黄土高原（35°43′50″N，107°41′4″E）黑垆土耕作层（0～20 cm），风干后过3 mm 孔筛，备用。土壤有机质11.83 g·kg-1，速效氮37.4 mg·kg-1，速效磷（P2O5）7.25 mg·kg-1，速效钾（K2O）182.5 mg·kg-1，水溶性总盐0.773 g·kg-1，pH=7.92。裸燕麦品种‘定莜9号’种子购自甘肃省定西市农业科学研究院；
NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3、NaHS 从上海生工生物工程股份有限公司采购；
复合肥购于甘肃省庆阳市田田圈农化有限公司；
试验用塑料盆口径31.5 cm，底径25.0 cm，高34.0 cm，配底托。
过筛土样分成2 组：一组中不添加NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3；
另一组添加总质量分数3.00 g·kg-1（包括土壤盐碱背景值）的中性盐和碱性盐（n（NaCl）∶n（Na2SO4）∶n（Na2CO3）∶n（NaHCO3）=12∶8∶1∶9）。两组土样均添加0.5 g·kg-1（土）氮磷钾（13-17-15）复合肥和0.269 L·kg-1（土）有机草碳基质，各自拌匀后每盆装土22.0 kg，浇水至田间持水量75%沉实3 d 后播种（4 月6 日），每盆播大约60粒种子，覆土3 cm，常规管理。5月9日定苗，每盆保留一致壮苗25 株。裸燕麦生长至抽穗期（6月18日）时进行喷施处理。
1.2 试验设计
试验设置4 个处理：（1）对照（CK），盆土不添加中性盐和碱性盐，叶面喷施蒸馏水；
（2）盐碱胁迫（salt-alkali stress，SA），盆土添加中性盐和碱性盐，叶面喷施蒸馏水；
（3）SA+NaHS，盆土添加中性盐和碱性盐，叶面喷施50 μmol·L-1NaHS 溶液；
（4）NaHS，盆土不添加中性盐和碱性盐，叶面喷施50 μmol·L-1NaHS溶液。
每个处理6 盆（3 盆用作有机酸和植物激素检测，另3 盆用于成熟后籽粒产量统计），4 次重复，复拉丁方设计排布，共192盆。喷施用手持压缩式喷雾器（成都市鑫桂塑胶有限公司）在裸燕麦抽穗期早晚各喷施1 次，连续喷3 d，每盆喷施量150 mL 左右。为提高喷施液与叶面的黏附性，喷施液中添加体积分数为0.01%的Tween-80。喷施结束后第7 天取植株倒数第2 叶，用吸水纸擦拭干净，装入冻存管置液氮速冻后用干冰包埋寄至苏州帕诺米克生物医药科技有限公司检测有机酸和植物激素含量。7 月20 日裸燕麦成熟后收获，测定籽粒产量构成。
1.3 测定项目与方法
委托苏州帕诺米克生物医药科技有限公司运用Vanquish Flex 型超高效液相色谱仪（美国Thermo Scientific 公司）和Q Exactive 型高分辨质谱仪（美国Thermo Scientific 公司）检测12 种有机酸和15种植物激素含量。
1.3.1 有机酸
1.3.1.1 样品提取
精确称量50 mg 冻样于2 mL EP 管中，加入1颗钢珠，加入500 μL 体积分数30%甲醇溶液，高通量组织研磨仪60 Hz 研磨120 s，12 000 r·min-14 ℃离心10 min，取上清液20 μL，加入80 μL 体积分数30%甲醇溶液混匀后加入到检测瓶中。
1.3.1.2 色谱参数
液相色谱采用ACQUITY UPLC®BEH C18 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，美国Waters 公司），柱温40 ℃，流动相A 为水，流动相B 为甲醇。梯度洗脱条件为0～6 min，28% B；
6～9 min，28～40% B；
9～10 min，40～50% B；
10～11 min，50% B；
11～13 min，30%B。进样量5 μL，流速0.25 mL·min-1。质谱条件：电喷雾电离源，负离子电离模式。离子源温度500 ℃，离子源电压-4 500 V，碰撞气6 psi，气帘气30 psi，雾化气和辅助气均为50 psi，采用多重反应监测进行扫描。对各标准溶液分别进行超高效液相色谱-质谱（ultra performanceliquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS）检测，以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，采用信噪比10∶1确定定量限及建立各有机酸标准曲线回归方程，根据标准曲线方程计算以材料鲜质量为基础的各样品有机酸含量（μg·g-1）。
1.3.2 植物激素
1.3.2.1 样品提取
称取100 mg 冻样，加入1 mL 冰冷的体积分数50%乙腈溶液，4 ℃超声3 min 后4 ℃提取30 min，以12 000 r·min-14 ℃离心10 min，取上清过RPSPE 柱，用氮气流蒸干样品，溶于200 μL 体积分数30%乙腈中，并转移至装有插入物的样品瓶中。
1.3.2.2 色谱条件
色谱柱为Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；
流动相A 为超纯水，流动相B 为乙腈；
流速0.3 mL·min-1；
柱温40 ℃；
进样量2 μL。洗脱梯度：0 minV（水）∶V（乙腈）=90∶10，1 minV（水）∶V（乙腈）=90∶10，7 minV（水）∶V（乙腈）=90∶10，7.1 minV（水）∶V（乙腈）=10∶90，9 minV（水）∶V（乙腈）=10∶90。质谱参数：采用电喷雾离子源，鞘气40 arb；
辅助气10 arb；
离子喷雾电压-2 800 V；
温度350 ℃；
离子传输管温度320 ℃。扫描模式为单离子检测模式；
扫描方式为正离子或负离子。利用软件Trace Finder处理质谱数据，通过不同浓度标准品拟合曲线，用标准曲线计算以鲜质量材料表示的各样品激素含量，单位以ng·g-1表示。
1.3.3 产量构成因素
裸燕麦成熟后以每盆为单位，统计裸燕麦的穗数量、穗铃数量、穗粒数量，用天平（精度0.01 g）称量千粒质量和籽粒质量。
1.4 数据处理
运用SPSS 20.0 软件进行一般线性模型单变量无交互拉丁方设计多因素方差分析，新复极差法比较处理间的5%差异显著性。用Simca14.1 软件对有机酸和激素含量等方差缩放后偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）和隐结构正交投影判别分析（orthogonal projection to latent structure-discriminant analysis，OPLS-DA），筛选处理间含量显著的差异有机酸和植物激素。将不同处理裸燕麦产量构成因素进行主成分分析，以每个主成分特征根作为权数，计算不同处理产量性状综合得分。根据灰色系统理论，将产量性状综合得分和有机酸、激素含量视为1个灰色系统，参考张达斌等［26］的方法计算灰色关联系数和关联度。
2.1 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片有机酸含量的影响
由表1 可知，在裸燕麦叶片中检测出琥珀酸、丁烯二酸、苹果酸、柠檬酸、丙二酸、葡萄糖醛酸、泛酸、烟酸、焦谷氨酸、辛二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸12 种有机酸，其中质量分数大于1 000 μg·g-1的是柠檬酸、苹果酸和泛酸，质量分数小于10 μg·g-1的是烟酸、辛二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸，其余5 种有机酸质量分数介于10～100 μg·g-1。不同处理引起裸燕麦叶片中有机酸含量发生显著改变。与CK 相比，SA 处理显著提高了琥珀酸、丁烯二酸、苹果酸、葡萄糖醛酸和总有机酸含量，显著降低了焦谷氨酸含量，对柠檬酸、丙二酸、泛酸、烟酸、辛二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸含量无显著影响。与SA 处理相比，SA+NaHS 处理的3-羟基-3-甲基谷氨酸含量显著提高，葡萄糖醛酸含量显著降低，琥珀酸、丁烯二酸、苹果酸、柠檬酸、丙二酸、泛酸、烟酸、焦谷氨酸、辛二酸、苯丙酮酸和总有机酸含量无显著变化。与CK 相比，单独NaHS处理的焦谷氨酸、辛二酸、葡萄糖醛酸含量显著提高，琥珀酸、丁烯二酸、苹果酸、柠檬酸、丙二酸、泛酸、烟酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、苯丙酮酸和总有机酸含量无显著变化。
表1 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片有机酸含量的影响Table 1 Effects of exogenous hydrogen sulfide on the content of organic acids in leaves of naked oat under saline-alkali stress
2.2 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片有机酸组成的PLS-DA分析
PLS-DA 是有监督的判别分析方法，R2X、R2Y和Q2各自代表模型对矩阵X、Y的拟合度和预测能力［27］。将不同处理裸燕麦叶片中有机酸含量经PLS-DA 分析，R2X=0.631，R2Y=0.526，Q2=0.331，说明模型拟合较好。由图1A 得分图可见，CK、NaHS、SA、SA+NaHS 处理各自归为一类，表明4个不同处理间有机酸含量存在差异。经200次置换检验（图1B）显示，置换检验中随机产生的R2在纵轴上的截距小于0.4，Q2值在纵轴上的截距小于0.05。说明PLS-DA 没有出现模型过拟合现象，可以依据PLSDA 分析获得的变量投射重要度（variable importance for the projection，VIP）值筛选差异代谢物。根据VIP＞1 且方差分析P＜0.05 筛选出辛二酸、葡萄糖醛酸、焦谷氨酸、丁烯二酸和3-羟基-3-甲基谷氨酸5种差异氨基酸。
图1 不同处理下裸燕麦叶片有机酸PLS-DA得分图（A）及200次模型的置换检验（B）CK.无盐碱胁迫下喷水；
SA.盐碱胁迫下喷水；
SA+NaHS.盐碱胁迫下喷NaHS；
NaHS.无盐碱胁迫下喷NaHS；
下同Fig.1 PLS-DA score plot of organic acids in naked oat leaves under different treatments（A）and 200 permutation test of the mode（lB）CK.Spraying water under no salt-alkali stress；
SA.Spraying water under salt-alkali stress；
SA+NaHS.Spraying NaHS under salt-alkali stress；
NaHS.Spraying NaHS under no salt-alkali stress；
The same as below
2.3 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片有机酸组成的OPLS-DA分析
为提高模型参数对矩阵X/Y关联度解释，将不同处理裸燕麦叶片有机酸OPLS-DA 分析。如图2：A，C，E 结果表明：处理CK、SA、SA+NaHS、NaHS各自聚为一族，充分显示各处理间有机酸含量存在明显差异。根据OPLS-DA 分析的VIP＞1 且95%置信区间不包括零筛选并结合S-图解析可知：与CK相比，SA处理含量显著上调的差异有机酸是葡萄糖醛酸、琥珀酸、丁烯二酸、苹果酸、丙二酸5种，含量显著下调的有机酸是焦谷氨酸（图2B）。与SA 处理相比，SA+NaHS 处理的3-羟基-3-甲基谷氨酸含量显著上调，而烟酸和葡萄糖醛酸含量显著下调（图2D）；
与CK 相比，单独NaHS 处理下辛二酸、葡萄糖醛酸、丁烯二酸、泛酸和丙二酸5种有机酸含量存在显著差异，而且这5种有机酸含量全部上调（图2F）。
图2 不同处理下裸燕麦叶片有机酸OPLS-DA得分图（A、C、E）和S形图（B、D、F）A～B.CK vs SA；
C～D.SA vs. SA+NaHS；
E～F.CK vs. NaHS；
Succi.琥珀酸；
Butene.丁烯二酸；
Malic.苹果酸；
Citric.柠檬酸；
Malonic.丙二酸；
Glucu.葡萄糖醛酸；
Panto.泛酸；
Nicotinic.烟酸；
Pyrog.焦谷氨酸；
Suberic.辛二酸；
HMA.3-羟基-3-甲基谷氨酸；
Phenyl.苯丙酮酸Fig.2 OPLS-DA score plo（tA，C，E）and S-plo（tB，D，F）of organic acids in naked oat leaves under different treatment A-B.CK vs.SA；
.C-D.SA vs.SA+NaHS；
E-F.CK vs.NaHS；
Succi.Succinic acid；
Butene.Butenedioic acid；
Malic.Malic acid；
Citric.Citric acid；
Malonic.Malonic acid；
Glucu.Glucuronic acid；
Panto.Pantothenic acid；
Nicotinic.Nicotinic acid；
Pyrog.Pyroglutamic acid；
Suberic.Suberic acid；
HMA.3-Hydroxy-3-methylglutaric acid；
Phenyl.Phenylpyruvic acid
2.4 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片激素含量的影响
从表2 可见，在裸燕麦叶片中检测出IAA、赤霉素A1（gibberellin A1，GA1）、赤霉素A3（gibberellin A3，GA3）、赤霉素A4（gibberellin A4，GA4）、赤霉素A7（gibberellin A7，GA7）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、茉莉酸-异亮氨酸（jasmonoyl-isoleucine，JA-Ile）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJA）、ABA、反式-玉米素（trans-zeatin，tZ）、反式-玉米素核苷（trans-zeatin-riboside，tZR）、N6-（Δ2-异戊烯）腺嘌呤［N6-（Δ2-Isopentenyl）adenine，iP］、N6-（Δ2-异戊烯基）腺苷［N6-（Δ2-Isopentenyl）adenosine，iPA］、1-氨基环丙烷羧酸（1-aminocyclopropanecarboxylic acid，ACC）等12种激素，未检出油菜素内酯，其中质量分数大于1.000 ng·g-1的是ABA、JA、JA-Ile 和IAA，质量分数介于0.100～1.000 ng·g-1的是MJA、GA3、tZ、ACC，其余6 种激素质量分数小于0.100 ng·g-1。方差分析表明，与CK 相比，SA 处理显著降低了JA-Ile、tZ和iP 含量，其余激素含量无显著变化。与SA 处理相比，SA+NaHS 处 理显著提高了IAA、GA7、MJA、iP 含量，显著降低了GA3、GA4和ACC 含量，对GA1、JA、JA-Ile、ABA、tZ、tZR、iPA 含量无显著影响。与CK 相比，单独NaHS 处理的IAA、GA1、GA3、GA7、MJA、ABA、ACC 含量显著提高，iP 含量显著降低，GA4、JA、JA-Ile、tZ、tZR、iPA 含量无显著变化。
表2 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片激素含量的影响Table 2 Effects of exogenous hydrogen sulfide on the content of hormone in leaves of naked oat under saline-alkali stress
2.5 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片激素含量的PLS-DA分析
将不同处理裸燕麦叶片激素含量经PLS-DA分析R2X=0.554，R2Y=0.676，Q2=0.548，说明模型拟合好。图3A 得分图显示，CK、NaHS、SA、SA+NaHS处理较好各自归为一类，说明不同处理激素含量存在差异。经200 次置换检验（见图3B）显示，置换检验随机产生的R2在纵轴上的截距小于0.4，Q2值在纵轴上的截距小于0.05。说明PLS-DA 没有出现模型过拟合现象。根据VIP＞1且方差分析P＜0.05 筛选，tZ、GA4、MJA、ACC、ABA、GA7和GA3为含量差异激素。
图3 不同处理下裸燕麦叶片激素PLS-DA得分图及200次模型的置换检验Fig.3 PLS-DA score plot of hormones in naked oat leaves under different treatments and 200 permutation test of the model
2.6 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片激素组成的OPLS-DA分析
不同处理裸燕麦叶片激素含量OPLS-DA 分析结果（见图4：A、C、E）显示，处理CK、SA、SA+NaHS、NaHS 各自聚为一族，充分显示处理间激素含量存在明显差异。根据OPLS-DA 分析的VIP＞1 且95%置信区间不包括零筛选并结合S-图解析可知，与CK 相比，SA 处理含量显著上调的差异激素是MJA、GA1、iPA，含量显著下调的激素是tZ、ABA、JA-Ile（见图4B）。与SA 处理相比，SA+NaHS 处理下MJA、GA7、tZ 和IAA 含量显著上调，而GA4、ACC、tZR 和GA3含量显著下调（见图4D）；
与CK 相比，单独NaHS 处理下MJA、GA7、GA1和ABA 含量显著上调，而iP 和GA4含量显著下调（见图4F）。
图4 不同处理下裸燕麦叶片激素OPLS-DA得分图（A、C、E）和S形图（B、D、F）A～B.CK vs.SA；
C～D.SA vs.SA+NaHS；
E～F.CK vs.NaHS；
IAA.吲哚乙酸；
GA1.赤霉素A1；
GA3.赤霉素A3；
GA4.赤霉素A4；
GA7.赤霉素A7；
JA.茉莉酸；
JA-Ile.茉莉酸-异亮氨酸；
MJA.茉莉酸甲酯；
ABA.脱落酸；
tZ.反式-玉米素；
tZR.反式-玉米素核苷；
iP.N6（-Δ2-异戊烯）腺嘌呤；
iPA.N6（-Δ2-异戊烯基）腺苷；
ACC.1-氨基环丙烷羧酸Fig.4 OPLS-DA score plo（tA，C，E）and S-plo（tB，D，F）of hormones in naked oat leaves under different treatment A-B.CK vs.SA；
C-D.SA vs.SA+NaHS；
E-F.CK vs.NaHS；
IAA.Indole-3-acetic acid；
GA1.Gibberellin A1；
GA3.Gibberellin A3；
GA4.Gibberellin A4；
GA7.Gibberellin A7；
JA.Jasmonic acid；
JA-Ile.Jasmonoyl-isoleucine；
MJA.Methyl Jasmonate；
ABA.Abscisic acid；
tZ.Trans-zeatin；
tZR.Trans-zeatin-riboside；
iP.N6（-Δ2-Isopentenyl）adenine；
iPA.N6（-Δ2-Isopentenyl）adenosine；
ACC.1-Aminocyclopropanecarboxylic acid
2.7 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片不同类激素总量和总量比值的影响
从表3 可见，与CK 相比，SA 处理显著降低了CTK 含量，其他种类激素总量及激素比例无显著变化。与SA 处理比较，SA+NaHS 处理显著提高了IAA 含量及IAA/ABA 比值，显著降低了GAs、ACC含量及ACC/ABA 比值，对其他种类激素总量和激素比值无显著影响。与CK 比较，单独NaHS 处理显著提高了IAA、GAs、JAs、ABA 和ACC 含量，对CTK含量和不同激素比值无显著影响。
表3 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦叶片6类激素总量和总量比值的影响Table 3 Effects of exogenous hydrogen sulfide on the total amount of different hormones and the ratio of total hormone amount in leaves of naked oat under saline-alkali stress
2.8 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦产量构成因素的影响
从表4 可知，SA 处理下裸燕麦穗数量、穗铃数量和千粒质量分别与CK 的差异不显著，而穗粒数量和籽粒产量显著下降。SA+NaHS 处理与SA 比较，穗数量、穗铃数量和千粒质量无显著差异，穗粒数量和籽粒产量显著提高。单独NaHS 处理与CK 比较，穗数量、穗铃数量、穗粒数量、千粒质量和籽粒产量无显著差异。
表4 外源硫化氢对盐碱胁迫下裸燕麦产量构成因素的影响Table 4 Effects of exogenous hydrogen sulfide on yield components of naked oat under saline-alkaline stress
2.9 裸燕麦有机酸、激素含量和产量性状变化的灰色关联度分析
由表5 可知，在不同处理下裸燕麦有机酸、激素含量与产量性状的密切程度（关联序）顺序为：焦谷氨酸＞tZ＞ABA＞烟酸＞JA-Ile＞辛二酸＞丙二酸＞tZR＞JA＞GA1＞3-羟基-3-甲基谷氨酸＞泛酸＞GA3＞苯丙酮酸＞苹果酸＞GA4＞MJA＞iPA＞IAA＞柠檬酸＞ACC＞丁烯二酸＞GA7＞iP＞葡萄糖醛酸＞琥珀酸，且关联度均在60%以上。
表5 裸燕麦有机酸、激素含量与产量性状的关联度和关联序Table 5 Correlation coefficient and order between organic acid and hormone content and yield traits of naked oat
Guo 等［6］研究证明，植物有机酸代谢的独特调节与其盐、碱耐性密切相关。而H2S通过调控植物激素水平可减轻逆境胁迫对植物的氧化损伤［28］。本研究结果显示，外源H2S对盐碱复合胁迫下裸燕麦不同种类有机酸和激素含量存在显著影响，且不同程度减轻盐碱复合胁迫造成的裸燕麦穗数量、穗铃数量、穗粒数量、千粒质量和籽粒产量的下降幅度（见表4）。已有研究证明，外源H2S 通过增强抗氧化能力可减轻盐诱导的氧化损伤，并维持叶绿素荧光和提高硝酸还原酶活性［22-23，29］；
改善光合性能［30］，调节非选择性阳离子通道和盐超敏感通路降低Na+含量［31］；
调控质膜Na+/H+逆向转运系统维持矿质离子稳态［20-21，32］，从而缓解盐胁迫对植物生长的抑制。本研究结果说明，外源H2S对有机酸和激素水平的调控可能是其缓解裸燕麦产量性状下降，增强裸燕麦盐碱耐受的重要原因之一。
有机酸不仅是植物适应盐碱胁迫的重要渗透调节剂，也是负电荷贡献者，还在离子平衡和pH调节中发挥着重要作用［6］。然而，已有的盐、碱胁迫下植物积累有机酸的研究结果并不一致，未见H2S 对盐碱复合胁迫下植物有机酸积累调控的研究。杨国会［5］研究发现，盐胁迫不影响小冰麦（Triticum aestivum-Agropyron intermedium）中有机酸含量，而碱胁迫显著诱导其有机酸急剧增加。另一些研究［7-11］则表明，盐、碱胁迫均诱导有机酸积累，并改变有机酸组成，但盐胁迫和碱胁迫下有机酸的积累特征存在明显差异，如郭立泉等［9］的研究显示，星星草茎叶中的有机酸含量随着盐胁迫强度增大而下降，而随碱胁迫强度提高有机酸含量急剧上升。本研究中，裸燕麦叶片中的焦谷氨酸、烟酸、辛二酸、丙二酸、3-羟基-3-甲基谷氨酸、泛酸和苯丙酮酸的含量与产量性状的关联度高（见表5）。盐碱复合胁迫不仅显著提高裸燕麦叶片中总有机酸含量，还使琥珀酸、丁烯二酸、苹果酸、葡萄糖醛酸含量显著提高，但同时显著降低了焦谷氨酸含量（见表1）。外源H2S 对正常条件和盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片中有机酸总量影响不大，而显著改变了有机酸的组成，使盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片中3-羟基-3-甲基谷氨酸含量显著提高，而葡萄糖醛酸含量显著下降。OPLS-DA 分析发现，盐碱复合胁迫下外施H2S含量显著上调的是3-羟基-3-甲基谷氨酸，而烟酸和葡萄糖醛酸含量显著下调（见图2D）。这表明外源H2S 对盐碱胁迫下叶片3-羟基-3-甲基谷氨酸下降的显著上调作用可能在H2S 减轻盐碱胁迫对裸燕麦产量性状抑制中发挥了重要作用，而烟酸和葡萄糖醛酸含量的变化可能在增强裸燕麦适应盐碱胁迫中发挥着独特作用，但具体的生理作用及其分子机制尚待进一步探究。
植物激素是一类生长调节物质。IAA 主要促进细胞伸长生长［18］；
CTK 促进细胞分裂和延缓叶片衰老，并调节许多酶活性［13］；
GAs 加速细胞分裂和促进细胞伸长［14］；
ABA 引起气孔关闭，抑制植物生长［16-17］；
乙烯促进开花、果实成熟、器官衰老和调控植物对逆境的适应［33］；
JAs 促进叶片衰老和脱落、气孔关闭、呼吸作用和蛋白质合成，抑制花芽形成、营养生长和光合作用［34］。一般认为，IAA、CTK 和GAs 为生长促进型激素，而ABA 和JAs 为生长抑制型激素，但不同种类激素的生理效应存在相互促进或颉颃作用，对植物生长发育的调控往往是多种激素综合作用的结果［35］。盐、碱胁迫会改变激素含量和分布，从而调节生理生化过程和生长发育，使植物适应盐、碱的能力增强［13-18］，且多数研究认为盐、碱胁迫诱导生长促进型激素减少，而生长抑制型激素增加［36］，但也有相反的研究报道［13-17］。Chang 等［37］研究表明，盐胁迫下黄瓜（Cucumis sativus）萌发种子中乙烯合成前体ACC合成乙烯的能力和乙烯积累量明显降低。本研究中，裸燕麦叶片中tZ、ABA、JA-Ile、tZR、JA、GA1的含量与其产量性状关联密切（见表5）。盐碱复合胁迫显著降低裸燕麦叶片JA-Ile、tZ 和iP 含量；
外源H2S 显著提高盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片IAA、GA7、MJA 和iP 含量，显著降低GA3、GA4和ACC 含量（见表2）。OPLS-DA分析显示，盐碱复合胁迫显著上调MJA、GA1、iPA 含量，显著下调tZ、ABA、JAIle 含量（图4B）；
外源H2S 显著上调盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片MJA、GA7、tZ 和IAA 含量，显著下调GA4、ACC、tZR 和GA3含量（见图4D）。这表明盐碱胁迫和盐碱胁迫下外施H2S 都会显著改变裸燕麦叶片中不同种类激素水平，其中JA-Ile 和tZ 含量的下降可能是盐碱胁迫导致裸燕麦产量性状下降最为主要的原因之一，而外源H2S 对IAA、GA7、MJA及iP或tZ等CTK的上调作用可能与其有效缓解盐碱胁迫裸燕麦产量性状降低密切相关。外源H2S参与不同逆境下植物激素水平的调控［28］，而它调控的激素改变与逆境下植物生长变化的关系尚需进一步揭示。
植物耐盐性不仅与植物激素绝对含量有关，而且与各类激素间的平衡关系更加密切［13］。刘海英等［38］研究表明，盐胁迫下小麦IAA/ABA 和GAs/ABA 比值显著降低。张丽等［39］研究发现，平欧杂种榛（Corylus heterophylla×C. avellana）体内（GA+IAA+ZR）/ABA 比值随盐或碱胁迫强度增大逐渐降低。本研究中，盐碱复合胁迫显著降低了裸燕麦叶片中CTK 含量，而对IAA、GAs、JAs、ABA 和ACC 总量及IAA/ABA、GAs/ABA、JAs/ABA、CTK/ABA、ACC/ABA 比值无显著影响；
外源H2S 显著提高了盐碱复合胁迫下裸燕麦叶片IAA 含量及IAA/ABA 比值，显著降低了GAs、ACC含量及ACC/ABA比值（见表3）。这说明盐碱胁迫并未显著改变裸燕麦叶片激素平衡，仅仅显著降低了CTK 的含量；
而外源H2S 不仅显著改变盐碱胁迫裸燕麦叶片激素水平，而且显著提高IAA/ABA 比值。Achard等［40］研究发现，高盐胁迫下，拟南芥（Arabidopsis thaliana）体内GAs 含量降低，同时伴随着DELLA蛋白（一类由环境诱导的多种激素共同调节的生长抑制因子）含量升高，引起生长抑制，从而增强拟南芥耐受盐胁迫的能力。盐胁迫对植物生长的抑制可能部分还通过激活乙烯信号途径完成［36］。IAA 影响植物多种生理过程，促进植物生长［18］，还能提高液泡膜H+-焦磷酸酶和质膜H+-ATP 酶表达水平和活性，将Na+转运出细胞或区隔化液泡内提供驱动力，从而增强植物耐盐性［41］。由此推测，外源H2S 可能通过降低GAs 和ACC 含量增强裸燕麦盐碱胁迫耐性，同时通过提高IAA/ABA 比值缓解盐碱胁迫对裸燕麦产量性状的抑制。然而，H2S对植物不同种类激素代谢的调控及其作用机制交织复杂，目前关于盐碱胁迫下植物内源激素对H2S响应机制的研究还少见报道，尚需进一步运用分子生物学等多种手段解析H2S 缓解植物盐碱胁迫的激素调控机制。
在盐碱胁迫下，喷施H2S能够显著上调裸燕麦叶片中3-羟基-3-甲基谷氨酸含量和下调烟酸、葡萄糖醛酸含量，提高IAA、GA7、MJA 及iP 或tZ 等细胞分裂素含量和IAA/ABA 比值，降低GA3、GA4和ACC 含量及ACC/ABA 比值，不同程度缓解裸燕麦穗数量、穗铃数量、千粒质量、穗粒数量和籽粒产量的下降幅度。说明外源H2S 参与盐碱胁迫下裸燕麦有机酸和激素代谢的调控，能够增强裸燕麦对盐碱环境的适应能力。
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