章川，李松军
(遵义医科大学第五附属(珠海)医院骨一科，广东 珠海 519100)
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种以软骨退变、软骨下骨硬化、骨赘形成以及滑膜炎症为特征的退行性关节疾病，可导致疼痛、畸形和关节功能障碍。临床治疗主要包括药物疗法、物理疗法和手术疗法，以及其他基于缓解疼痛的综合疗法，但上述治疗仅能够一定程度缓解疼痛，改善关节功能，无法从根本上逆转膝关节进一步退变的进程。近年来，细胞外囊泡(extracellular vesicies，EVs)在组织工程和再生医学领域的研究进展引起了广大学者的极大关注，并成为再生医学中控制炎症、修复损伤、促进再生等研究的新领域[1]。EVs包括外泌体(exosome，Exo)、微囊泡和凋亡小体，是细胞分泌传递生物信号的纳米级细胞间信使。EVs在OA软骨形成和软骨再生中具有潜在作用，源自软骨细胞的EVs可在体外诱导祖细胞和干细胞分化为成熟的软骨细胞，这被认为是修复软骨损伤最有希望的治疗方法[2-3]。EVs还可提高抗炎和免疫调节细胞因子水平，并降低炎症细胞因子水平，因此，应用来自间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)的EVs治疗OA具有巨大潜力[4]。目前已知EVs在OA中具有一系列生理功能和病理作用，但其促进关节修复和减缓关节退行性病变的机制尚不完全清楚。现对EVs在OA中作用及治疗的研究进展予以综述。
EVs是异质双层脂质膜小泡的统称，直径通常为30～2 000 nm，其可作为各种生物活性信号分子的载体介导细胞间通信作用，已经成为研究疾病和组织修复的热点[5]。EVs是含有多种生物活性的分子，包括蛋白质、信使RNA、微RNA(microRNA，miRNA/miR)、脂肪和DNA。根据直径和生物起源途径可将EVs分为Exo、微囊泡和凋亡小体[6-7]。Exo是最小的EVs，直径30～150 nm，由多泡核内体产生并随着隔室和质膜的融合而释放。微囊泡(既往称为微粒)直径50～1 000 nm，其可直接从质膜脱落，与Exo相似，微囊泡可能包含核酸、蛋白质和脂质，且可以将上述信号分子转运至靶细胞。凋亡小体是目前已知的直径最大的EVs，直径超过1 000 nm，在细胞凋亡后期形成[8]。EVs可通过不同的机制与受体细胞进行交流，如通过跨膜蛋白与细胞表面受体相互作用，从而诱导细胞内信号通路，亦可通过与细胞膜直接融合或内吞作用释放到靶细胞中。未来仍然需要深入了解EVs的生物分子机制，以更好地标记不同类型的EVs。
2.1EVs在OA中的诊断潜力 EVs是OA病理学和病理生理学的新型生物标志物。OA软骨与正常软骨的蛋白质含量存在差异，主要由于OA软骨中细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分的变化。正常人群关节软骨囊泡的ECM含量远高于OA患者，其中包括Ⅱ型胶原、蛋白多糖、双糖链蛋白聚糖，故推测ECM破坏可能使OA患者上述相关蛋白减少，因此可从分子生物学角度对上述蛋白的含量进行检测，从而更准确地认识OA早期病变。
此外，OA的早期干预可延迟或防止早期OA的进一步发展。EVs作为关键的miRNA载体，对细胞间信息交流有重要作用，EVs-miRNA可作为OA的早期诊断标志物。miR-140在软骨细胞中高表达，对调节软骨稳态有重要作用，研究发现，OA患者的miR-140表达远低于正常人群[9]。miR-335-5p是OA保护性基因，可能在OA中发挥重要作用，何伟珍等[10]研究发现，OA患者的miR-335-5p水平低于正常人群。miR-155是一种自噬相关miRNA，在OA中呈高表达，其通过调节自噬相关蛋白的表达抑制OA软骨细胞自噬[11]。
与miRNA相似，长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)不仅是OA的潜在生物标志物，还参与了OA的病程。不同lncRNA可以靶向多种miRNA，如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13、Toll样受体4、Janus激酶，进而影响软骨细胞增殖、ECM降解及炎症反应[12]。lncRNA前列腺癌基因表达标记1(prostate cancer gene expression marker 1，PCGEM1)被认为是OA不同阶段的指标。研究显示，晚期OA滑膜液中Exo lncRNA PCGEM1的表达明显高于早期OA，表明滑膜中的Exo lncRNA PCGEM1可能是区分早期和晚期OA的有力指标[13]，这为准确诊断OA奠定了重要基础，并提升了分子水平上OA诊断的准确性，有助于对疾病进展做出更加精准的判断，并针对其分子水平变化制订治疗方案。
2.2EVs在OA中功能 EVs可以进入软骨细胞、成纤维样滑膜细胞和巨噬细胞[14-17]。在膝关节中，软骨细胞、成纤维样滑膜细胞和巨噬细胞通过滑液内EVs的相互作用，在OA的发病中发挥重要作用[18-19]。EVs不通过被动扩散侵入细胞，其可被白细胞介素(interleukin，IL)-1β和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α等炎症介质激活，常用于模拟关节炎环境的细胞培养实验。此外，OA滑膜细胞周围透明质酸基质的存在也可以促进EVs的内化，表明透明质酸基质外膜可作为EVs的天然载体[20]。有学者发现，EVs以多种方式影响成纤维样滑膜细胞和软骨组织。免疫细胞来源的EVs诱导了软骨降解蛋白酶(MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13)和炎症介质(IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1、单核细胞趋化蛋白2)在OA患者滑膜成纤维细胞中的合成[21]。关节软骨组织中的关节软骨囊泡可作为病理性钙盐晶体沉积形成病灶[22]。与人滑膜成纤维细胞来源的Exo相比，IL-1β来源的Exo刺激人滑膜成纤维细胞显著上调关节软骨细胞MMP-13和解聚蛋白样金属蛋白酶-5的表达，下调Ⅱ型胶原α1和聚蛋白聚糖的表达[23]。用OA滑液产生的EVs治疗正常关节软骨细胞可降低细胞存活和合成代谢基因(COL2、聚蛋白聚糖)的表达，增加TNF-α的表达，并提高MMP-2和MMP-9的活性[24]。Song等[25]研究发现，来源于OA的Exo可使正常软骨细胞增殖减少、凋亡增加。老年患者OA软骨细胞产生的EVs增加，这些EVs能够将衰老特征传递给邻近细胞，并减少前列腺素的产生[26]。此外，EVs可激活免疫细胞，OA患者滑膜细胞来源的Exo使M1型巨噬细胞释放细胞因子(IL-1β、IL-16)、趋化因子(CC趋化因子配体15、CC趋化因子配体20)和MMP(MMP-7、MMP-12)增加，在OA发病机制中发挥关键性作用[27]。
膝关节OA患者滑液来源的Exo可促进淋巴细胞趋化，抑制软骨细胞增殖[28]。EVs对关节组织结构的不利影响很多，但也有积极作用。中性粒细胞来源的EVs可激活软骨细胞合成代谢基因COL2A1、SOX9的表达，通过转化生长因子-β诱导ECM沉积和软骨保护，减少IL-8和前列腺素E2释放以及软骨细胞凋亡[15]。在小鼠模型中，正常条件下培养的原代软骨细胞来源的Exo能够延缓OA的恶化，还可诱导巨噬细胞向抗炎M2型巨噬细胞的极化[29]。在体外实验中，Exo通过增加细胞活力、增强COL2和聚蛋白聚糖表达以及减少MMP-13和解聚蛋白样金属蛋白酶-5的表达，延缓IL-1β诱发的软骨退化，并可恢复线粒体功能。此外，来源于M2型巨噬细胞的Exo可刺激原代软骨细胞中COL2A1和聚蛋白聚糖的表达[30]。且富血小板血浆来源的Exo可增加经IL-1β处理原代软骨细胞的增殖和迁移，减少软骨细胞的凋亡和TNF-α的释放[31]。
目前OA的主要治疗是减轻疼痛、改善关节功能，治疗方案包括手术治疗及非手术治疗。对轻度至中度膝关节OA患者，一般选择非手术治疗，主要包括镇痛、减重、理疗等。对于非手术治疗无效的晚期OA患者，可采用手术治疗，包括胫骨高位截骨术、人工关节置换术、关节镜下清理术等。MSC具有旁分泌作用，可合成和分泌多种生长因子，而趋化因子和细胞因子可以极大地影响其相邻细胞，同时MSC可分泌多种类型的EVs，如微囊泡和Exo。EVs具有缓解疼痛、抑制炎症、减缓软骨破坏的作用，未来 EVs联合自噬相关药物可能是治疗OA的重要方法。
3.1缓解疼痛并抑制炎症 目前，非甾体抗炎药和物理疗法是缓解OA疼痛的主要治疗方法，且两者联用效果更佳。He等[32]对碘乙酸钠诱导大鼠OA模型的研究显示，骨髓MSC来源Exo关节内注射可有效促进软骨修复和ECM合成，减轻膝关节疼痛，其中降钙素基因相关蛋白质水平降低是疼痛减轻的重要因素。Li等[33]的研究显示，骨髓MSC-Exo可通过消除腰椎小关节OA小鼠模型腰椎小关节软骨下骨中异常的降钙素基因相关肽阳性神经和异常的H型血管形成来减轻疼痛；
此外，骨髓MSC-Exo可减轻软骨退变，抑制抗酒石酸酸性磷酸酶表达和核因子κB受体活化因子配体-核因子κB受体活化因子-TNF受体相关因子6信号通路激活，促进软骨下骨重塑，表明骨髓MSC-Exo可以缓解腰痛的行为体征和腰椎小关节OA的病理过程。可见，血管生成的减弱以及软骨下骨骨侵蚀的减少是缓解腰椎小关节OA疼痛的主要原因，骨髓MSC-Exo可能是腰椎小关节OA的潜在治疗方案。
炎症与OA的发生和发展有关，损伤的软骨通过释放免疫细胞分泌的促炎性细胞因子(如IL-1、IL-8和MMP)引发炎症反应，导致软骨中ECM破坏[34-35]。因此，早期预防和抑制关节软骨破坏是阻断炎症联级反应、缓解OA疼痛症状的重要目标，但大部分试验尚处于体外实验研究阶段。来自不同干细胞的EVs对OA炎症有明确的治疗作用。EVs对软骨细胞有保护作用，Tofio-Vian等[36]将脂肪组织来源的MSC中分离出的EVs进行标记，发现其可减少TNF-α、IL-6、前列腺素E2和一氧化氮等炎症介质的产生，并增强MMP的活性，发挥抗炎作用。另有研究表明，EVs与活化的滑膜成纤维细胞共培养可下调促炎标志物的表达，并保护关节软骨细胞免于凋亡[37]。Vonk等[3]的研究表明，当与OA软骨细胞共培养时，人骨髓源性MSC分泌的EVs可抑制TNF-α介导的环加氧酶2和IL的上调，并可在体外促进软骨再生。Woo等[38]研究显示，巨噬细胞极化可抑制炎症反应，M1型巨噬细胞极化表达大量的促炎介质，如TNF-α、IL-12和IL-1β，MSC分泌的EVs可抑制RAW264.7细胞中促炎性细胞因子(环加氧酶2、IL-1β、IL-6和TNF-α)的表达，并促进M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞的极化。由此可见，EVs可能在OA的抗炎及减轻疼痛管理中具有重要的应用潜力。
3.2促进软骨再生与修复 在OA进展中，软骨损伤及缺失逐渐加重，导致疼痛症状和功能障碍越来越严重，目前晚期OA阶段的软骨损伤修复仍是临床OA治疗的重大挑战，EVs可抑制炎症反应、促进软骨细胞合成代谢，在OA治疗中发挥重要作用。OA中的炎症和氧化应激作用导致ECM和软骨细胞破坏和丢失，因此软骨细胞数量以及ECM生物合成的增加可减少OA相关并发症的发生。Tao等[39]对miR-155-5p高表达的滑膜MSC-Exo治疗OA的效果进行研究，结果表明，在体外不损害ECM分泌的情况下，滑膜MSC-Exo可增强软骨细胞的增殖和迁移，抑制细胞凋亡，并在一定程度上预防OA。Wong等[40]对外科手术诱发的兔软骨缺损模型进行研究显示，MSC-Exo与透明质酸联用的效果较单独使用透明质酸更好，且能够在12周后诱导持续的软骨修复。Zhang等[41]的研究证实，向手术诱发的膝关节软骨缺损大鼠关节内注射MSC-Exo，12周后软骨和软骨下骨完全恢复，且修复软骨组织可与相邻软骨组织完全融合。
除促进软骨细胞增殖外，EVs还具有诱导软骨细胞分化的潜力。Chen等[42]将软骨祖细胞-海藻酸盐植入小鼠皮下后，将从软骨细胞中提取的Exo移植到被植入部位，植入后12周，大量胶原在稳定的软骨组织中沉积，提示Exo可促进软骨形成。Zhu等[43]比较滑膜MSC分泌的Exo与诱导多能干细胞来源的MSC分泌的Exo对OA软骨损伤的疗效，结果显示，诱导多能干细胞来源的MSC分泌的Exo和滑膜MSC分泌的Exo均可刺激软骨细胞分化，且诱导多能干细胞来源的MSC分泌的Exo治疗OA的效果更佳。Wu等[44]研究发现，髌下脂肪垫干细胞来源Exo可延缓关节软骨退变、抑制细胞凋亡、增强基质合成、降低体外分解代谢因子表达、提高软骨细胞自噬水平，有助于维持软骨稳态。综上，EVs在软骨形成过程中具有重要作用，并可进一步提高EVs软骨的形成效率，但差异表达的EVs在软骨形成和软骨修复中的作用仍需更多体内外研究的确定。
EVs在OA发病、进展及治疗中发挥关键作用，未来在EVs用于OA的转化研究和治疗干预时，可根据现有的诊断和治疗进行评估。EVs可通过提高细胞活力、促进细胞增殖来抑制炎症，诱导组织修复和再生，并预防OA进一步恶化。理论上，EVs可以传递与其亲代细胞相同的信号，与直接细胞移植相比，EVs提供了更简单、更安全、更实用、更易控制的解决方案。目前，EVs研究仍处于早期阶段，且大多来源于细胞培养，但相关研究仍有一些问题有待明确：①EVs的类型、数量、细胞来源；
②EVs在各种关节组织中的稳定性及其在软骨组织中的运输；
③EVs的细胞识别及内化机制。基于EVs在OA治疗中显示出的研究及应用潜力，未来需要更多研究评估EVs在OA治疗过程中的确切机制。