贺富胤 ，李凤华 ，石 浩 ，王仁才
（1.湖南应用技术学院农林科技学院，湖南 常德 415100；
2.湖南农业大学园艺学院，长沙 410128；
3.河南农业大学园艺学院，郑州 450002）
猕猴桃（Actinidia chinensis Planch），一种多年生大型落叶藤本浆果果树[1]，其果肉鲜嫩多汁，口感适宜，且含有丰富的营养物质，包括丰富的维生素C和有多种不饱和脂肪酸、矿物质元素、蒽醌类、黄酮类、香豆素类和三萜类等有效用物质[2-4]，不仅具有保健功能，而且有多种药用功能[5-6]，因此深受人们喜爱。但是近年来，由于猕猴桃溃疡病的影响和发生，给猕猴桃产业的发展造成了巨大的影响。在生产中主要是通过园区管理、施用化学农药、选育出抗病品种和筛选抗性高的砧木进行嫁接等方法来进行防治猕猴桃溃疡病[7]。但随着人们对食品安全和环境保护的意识逐渐地提升，含多种营养物质、安全廉价、易降解且资源储备丰富的中药提取物抑菌剂受到人们关注[8-10]。
现阶段研究表明，中药提取物的抑菌机理主要是通过破坏或者影响微生物细胞壁、细胞膜的形态结构；
影响微生物细胞内正常的生理代谢和各种酶活性；
阻碍微生物的DNA或者RNA的复制表达等来发挥其抑菌杀菌的作用[11-12]。董洁洁[13]研究表明凤仙花提取液中的甲花醌和甲花甲醚是抑菌的主要成分，且通过室内抑菌试验和透射电镜观察，发现甲花甲醚可作用于白色念珠菌的细胞壁和膜系统，使其菌体电解质和部分内容物渗透流出，从而发挥抑菌作用。孙燕杰[14]通过对马齿苋提取物处理过的大肠杆菌的菌液碱性磷酸酶含量测定、透射电镜分析、胞内蛋白SDS-PAGE电泳分析和胞外可溶性蛋白含量测定发现细菌的细胞壁和细胞膜的结构发生了改变，细胞的通透性增加，且菌体内蛋白质的合成受阻。黄国霞等[15]研究发现山萘酚、桑色素、槲皮素和杨梅素可以影响大肠杆菌DNA的形态结构或者阻碍其DNA的复制和表达。尉研[16]在透射电镜下观察发现0.5 mg/mL的郁金提取物作用于油菜菌核菌和山葵墨入菌中，会使油菜菌核菌的细胞壁损坏丢失，细胞质溶解，线粒体嵴多处断裂，线粒体肿大。目前，国内外对中药复配物的抑菌机理的相关研究并不多，而本文前期通过对80种中药材的抑菌筛选，发现到黄芩、石菖蒲、丁香、广藿香、大蒜和牡丹提取物对猕猴桃溃疡病菌有较好的抑制效果，同时通过响应面试验得到这几种提取物的较佳抑菌复配配比为：0.09∶0.16∶0.26∶0.23∶0.08∶0.18。从而开展研究该中药复配物对菌体生长发育、细胞通透性和细胞超微结构等方面的影响，探讨该中药复配物对猕猴桃溃疡病菌的作用机理，为今后合理设计出高效无毒的猕猴桃溃疡病防治药剂提供依据。
1.1 试验材料
1.1.1 供试植物与菌种
黄芩、石菖蒲、丁香、广藿香、大蒜和牡丹购置于中药药店，猕猴桃溃疡病菌(P.syringae pv.actin⁃idiae)于湖南农业大学实验室通过柯赫氏法则与分子鉴定确定后，分离纯化所得。
1.1.2 试剂与仪器设备
试验试剂：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、丙酮（分析醇）、琼脂粉、氯化钠和碱性磷酸酶（AKP）试剂盒，电镜固定液，无水乙醇，以上均购于北京奥博星生物技术有限责任公司生产。
仪器设备：SCIENTZ-WSQ全自动微生物生长曲线分析仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；
Talos F200X S/TEM透射电镜，上海茁彩生物科技有限公司；
UV7600双光束紫外可见分光光度计，上海棱光技术有限公司；
DHP-9012电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；
TGL-21M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；
SW-CJ-1F超净工作台，三克仪器有限公司；
LANYI-XH2L超声循环提取机，上海兰仪实业有限公司；
LDZM-80LIII立式高压蒸汽灭菌锅，上海申安科技有限公司；
DHG-9146A干燥箱，上海申安科技有限公司；
YMB-5C全自动酶标仪，厦门亿恩达科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 菌液的制备
按照平板菌落计数法中的实验过程制备猕猴桃溃疡病病原菌悬浮液。在无菌条件下，用接种环将分离纯化后的病原菌取至装有0.9%氯化钠溶的液待测管中，混合摇匀后直至浓度与5×109CFU/mL的细菌比浊管标准管浓度相似，再通过10倍递减稀释和一定比例稀释成2×107CFU/mL菌悬液。从得到的菌液样品中取1 mL菌液至牛肉膏蛋白胨培养基中，在25℃的恒温培养箱中培养48 h后取出计数，根据菌落的数目换算验证菌液的浓度。
1.2.2 植物提取液的制备
将风干后的中草药用50℃的烘箱烘干至恒重，再用粉碎机粉碎后过100目筛，得到各中草药粉末样品。取各中草药粉末样品10 g分别加入到100 mL三角瓶中，再加入50 mL丙酮溶液，用保鲜膜封口后放在28℃，150 r/min的恒温振荡器上混合振荡12 h。混合振荡后将其放入条件为40℃，超声功率为700 w的超声仪中作用30 min，对得到各中草药提取液进行抽滤、浓缩，用丙酮定容配成质量浓度为1.0 g/mL的活性物质提取物。把配置好的活性提取物在无菌条件下倒入已灭菌的试管，得到各中草药提取母液，再将它们按比例混合配置成1.0 g/mL中药复配物，其各类中药提取物比例为黄芩∶石菖蒲∶大蒜∶广藿香∶牡丹∶丁香=0.09∶0.16∶0.26∶0.23∶0.08∶0.18。
1.2.3 中药复配物最低抑菌浓度（MIC）值及最低杀菌浓度（MBC）值的测定
将配置好的中药复配物倒入灭菌后的小试管中，用丙醇稀释，用十倍稀释法和二倍稀释法将其稀释成最终浓度为 1 000、400、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.781 mg/mL的溶液，对稀释后的提取物液进行编号，置于0～4℃冰箱中，保存备用。取上述制备好的0.5 mL的菌悬液于牛肉膏蛋白胨培养基上，用灭菌后的小毛刷涂匀在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，将牛津杯插入培养基中心，往牛津杯中间滴加已经稀释了的中药复配物，置于25℃的培养箱中避光培养72 h，观察病原菌的生长状况。以滴加丙酮为对照，抑菌圈刚好大于丙酮对照组即为最低抑菌浓度（MIC），抑菌圈刚好大于最低抑菌浓度的为最低杀菌浓度（MBC）。
1.2.4 菌体生长曲线的测定
将MIC、MBC浓度的中药复配物和丙酮分别滴加到1.5 mL的菌液中，置于25℃的恒温培养箱中，每隔1 h取样1次，用自动生长曲线测定仪测定600 nm处的吸光度，观察24 h内，OD600值的变化，并绘制猕猴桃溃疡病菌的生长曲线，以滴加丙酮的菌液为对照。
1.2.5 中药复配物对菌体细胞壁的影响
碱性磷酸酶（AKP）是一种含锌的非特异性磷酸单酯酶，对于磷酸基团的代谢转移有重要作用，在碱性环境中可催化水解脂键、蛋白质肽键等[17-18]。一般在细胞壁和细胞膜之间存有碱性磷酸酶(AKP)，只有在细胞壁被破坏导致细胞通透性增加时，碱性磷酸酶(AKP)才会溢漏到细胞外，从而检测到其活性，因此可以通过检测细胞外碱性磷酸酶(AKP)的活性变化来反应细胞壁通透性的改变[19-20]。往已培养72 h的3组菌悬液中分别滴加最低抑菌浓度的中药复配物、最低杀菌浓度的中药复配物与丙酮试剂后，置于25℃的恒温培养箱中培养，每隔1 h将其置于，转速为8 000 r/min的冷冻离心机中，离心10 min，取上层清液待测。按照碱性磷酸酶（AKP）测试盒方法处理[21]，用酶标仪测定520 nm处其吸光度，根据说明公式5-1计算并记录碱性磷酸酶（AKP）的含量变化。
公式 5-1：AKP活性（nmol/min/mL）=（测定OD520-空白OD520）÷（标准OD520-空白OD520）×标准品浓度÷测定样品浓度
1.2.6 中药复配物对菌体细胞膜的影响
当细菌细胞膜被破坏时，会使得菌体的通透性增大，菌体内的大分子物质，如蛋白质、DNA等，容易流出，而DNA和RNA在260 nm处有较大的吸收值，因此可以通过测定处理后的菌体离心液的OD260的变化，来判断细胞膜是否损坏和菌体通透性改变程度[22]。将最低抑菌浓度与最低杀菌浓度的中药复配物分别滴加到1.5 mL的菌液中，混匀后置于25℃的恒温培养箱中，设立滴加丙酮的菌液为对照组。每隔1 h将其置于，转速为3 600 r/min的冷冻离心机中，离心10 min，取上层清液用紫外分光光度计测定260 nm处的吸光度，测取8次，并统计记录。
1.2.7 中药复配物对菌体DNA含量的影响
DNA是生物正常生长繁殖不可或缺的物质，DNA缺损或者会导致菌体内许多酶无法正常的表达或者合成，影响其生命活动，使致生物体无法保持活性逐渐死亡。琼脂糖凝胶电泳中的DNA条带亮暗程度显示了DNA分子含量的多少，因此可通过对比DNA条带亮度来阐释处理组和对比组的DNA含量的不同[23]。将MBC浓度的中药复配物和丙酮分别滴加到生长对数期的菌液中，每个处理做3组重复，根据细菌DNA提取试剂盒说明提取2组处理的DNA，进行1%琼脂糖凝胶电泳分离检测、染色和凝胶成像后拍照观察并分析。
1.2.8 菌体细胞超微结构观察
制作丙酮处理、中药复配物MIC和MBC浓度处理的3组菌体电镜透射样本。将长于固体培养基的，且处于生长对数期的细菌连带着部分培养基一起挑置于电镜固定液中，常温条件下固定2 h后转移至4℃的冰箱中保存；
将处于生长对数期的细菌菌液置于冷冻离心机中，转数为4 000 r/min，离心10 min后，弃掉培养基液，收集细菌沉淀至小绿豆大小即可，再用电镜固定液在常温下固定2 h，后转移至4℃的冰箱中保存备用。将制作的样本用冰袋运输送至上海茁彩生物科技有限公司进行透射观察。
2.1 中药复配物的最低抑菌浓度（MIC）值及最低杀菌浓度（MBC）值
中药复配物提取液对猕猴桃溃疡病菌的最低抑菌和杀菌浓度见表1。由表1可知，当中药复配物浓度为3.125 mg/mL时，出现抑菌圈，且随着浓度的升高，其抑菌效果也越来越好，中药复配物最低抑菌浓度非常低，仅为3.125 mg/mL。中药复配物最低杀菌浓度为12.5 mg/mL。
表1 中药复配物对猕猴桃溃疡病菌的抑菌效果Table 1 Chinese medicine compound with content of kiwi canker bacteria antibacterial effect
2.2 细菌生长曲线的测定
图1为丙酮试剂和中药复配物处理后的细菌生长曲线图，从图中可以明显看出丙酮对照组的OD600值比中药复配物处理后的2组要高，表明其细菌数量最多，在培养4 h时即达到生长对数期，而处理后的菌体生长繁殖受到了抑制，在5～6 h后才到对数期，且经最低杀菌浓度处理后的猕猴桃溃疡病菌生长抑菌最明显，OD600值最低。
图1 中药复配物对猕猴桃溃疡病菌生长曲线的影响Figure 1 Chinese traditional medicine compound with content of kiwi canker pathogen growth curve
2.3 中药复配物对菌体细胞壁的影响
中药复配物处理后，菌体细胞外碱性磷酸酶(AKP)的活性变化如图2所示，从图中可以看出，在滴入中药复配物后，AKP活性相对丙酮对照组明显都高，且作用4 h后，AKP活性值有向上增长的趋势，表明菌液中AKP活性值开始变大，细胞通透性增加。其中经最低杀菌浓度处理后的AKP活性值最高，在作用前4 h的时间内，AKP活性逐渐降低，可能是由于复配物刚加入，杀死了大部分细菌，随后细菌生长繁殖变多，使其单位体积里的AKP活性降低，4 h后，AKP活性逐渐升高可能是因为随着细菌的增加，中药复配物破坏的菌体细胞壁越多，死亡的细菌也变多，使得AKP活性值增加。
图2 中药复配物对猕猴桃溃疡病菌细胞壁的影响Figure 2 Chinese traditional medicine compound with content of kiwi canker bacteria cell wall
2.4 中药复配物对菌体细胞膜的影响
从图3中可以明显发现，随着时间的增长，3组处理的OD260值也跟着增大，其中最低杀菌浓度处理后的菌液OD260最高，最低抑菌浓度处理后的次之，丙酮试剂处理后的最低，表明经中药复配物处理后的菌体，细胞膜受到影响，细胞通透性增大，导致菌体内的DNA和RNA等物质大量流出，其OD260值越高，表明细胞膜破坏程度越高，流出的紫外物质越多。
图3 中药复配物对猕猴桃溃疡病菌细胞膜的影响Figure 3 Effect of chinese medicine compound on cell membrane of kiwifruit ulcer pathogen
2.5 中药复配物对菌体DNA含量的影响
从图4中可以看出丙酮处理组的3个DNA条带比MBC处理组的3个DNA条带要清晰，因此可以得出经中药复配物处理后的猕猴桃溃疡病菌的DNA含量比正常菌体的DNA含量要少，经中药复配物处理后，菌体的细胞通透性改变，使得细胞内部的DNA分子外泄，胞内的DNA分子含量降低。此测定结果同上述中药复配物对菌体细胞膜影响的测定结果一致。
图4 中药复配物对猕猴桃溃疡病菌DNA含量的影响Figure 4 Effect of chinese medicine compound on DNA content of kiwifruit ulcer pathogen
2.6 细菌透射电镜观察
从图5中可以看出，丙酮处理的对照组（a）菌体呈现杆状，形态正常，菌体饱满，细胞壁、细胞膜完整无损害。而MIC处理组（b）的菌体形态明显扭曲变形，甚至有个别部位出现缺损，使致菌体内容物外泄。MBC处理组（c）的菌体不饱满，细胞壁、细胞膜出现明显破坏溶解，细胞内物质大量流出。
图5 丙酮处理和中药复配物处理后的猕猴桃溃疡病菌菌体透射电镜图Figure 5 Transmission electron microscope image of kiwifruit ulcer bacteria treated with acetone and chinese herbal compound
本文通过测定黄芩、石菖蒲、丁香、广藿香、大蒜和牡丹提取物按比例为0.09∶0.16∶0.26∶0.23∶0.08∶0.18组成的中药复配物提取液对猕猴桃溃疡病菌的最低抑菌（MIC）和杀菌浓度（MBC）、描绘细菌生长曲线以及结合中药复配物对菌体细胞壁和细胞膜的影响分析、并以电镜透射辅助观察菌体形态结构的变化，综合判断分析中药复配物对猕猴桃溃疡病菌的作用效果。试验结果表明，中药复配物最低抑菌浓度非常低，仅为3.125 mg/mL；
中药复配物最低杀菌浓度为12.5 mg/mL。正常菌液初始OD600值为0.2左右时，需培养后4 h后到达其生长对数期，该试验结果同黄其玲等[24]研究结果相似。经中药复配物处理后的菌体生长繁殖明显受到了抑制，其生长到达对数期时间要比正常的晚1～2 h，且菌体的细胞壁、细胞膜及胞内的NDA含量受到较大的影响。本研究通过胞外碱性磷酸酶（AKP）活性的测定，表明中药复配物处理后的猕猴桃溃疡病菌体的细胞壁被严重破坏，使其细胞膜裸露在外。Kong M.等[25]表明植物精油抑菌物质可作用于菌体细胞膜，改变其形态结构，从而使菌体死亡，而本实验的中药复配物液也含有植物精油抑菌物质，与本研究结果一致。综上所述，该中药复配物对猕猴桃溃疡病菌的抑菌机理主要表现为：降低细菌的生命活性，使其生长繁殖缓慢；
破坏菌体细胞壁和细胞膜，使胞内的物质流出；
影响菌体形态结构，使菌体扭曲变形；
降低菌体内DNA的含量，使菌体无法正常生长繁殖。