陈海燕，曾雪莉
（湖北省随州市曾都医院妇产科，随州 441300）
宫颈癌（cervical cancer）在子宫颈表面的组织中发展，是影响全世界女性的最常见的癌症之一，每年有大量的的女性因此而死亡[1]。发生子宫颈癌的主要危险因素是人乳头瘤病毒（HPV）的持续感染，且其感染通常是无症状和短暂的[2]。筛选和治疗方法的进步显着改善了临床结局，然而由于对标准疗法化疗的耐药性发展，晚期宫颈癌的治疗仍然是一个挑战[3]。因此探寻治疗宫颈癌的有效方式是迫切的。抗肿瘤中药由于高抗癌效力和低毒性，已在临床上得到广泛应用，传统中药与健康生活方式的结合通常可以完全缓解轻度和中度疾病。花旗松素（Taxifolin）又名二氢槲皮素、紫叶杉素，是提取自水红花子、土茯苓等植物中的一种生物类黄酮准维生素P，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、消炎等多种药理活性[4]。已有研究表明花旗松素具有良好的体外抑制人宫颈癌Hela细胞增殖作用[5]。目前还没有关于花旗松素对宫颈癌SiHa细胞影响的研究，本文旨在研究花旗松素对宫颈癌SiHa细胞自噬，凋亡和衰老的影响，以期为宫颈癌的临床治疗提供实验依据。
1.1 药物与主要试剂 花旗松素（批号：111816-201102，纯度≥98.9%，中国食品药品检定研究院）；
达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium，DMEM）培养基、胎牛血清、胰蛋白酶和青-链霉素（货号分别为：12100-046、10082-147、10082-147、15140-122，均购于美国 Gibco公司）；
MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒（批号：G020-1-1，南京建成生物工程研究所）；
CCK-8试剂盒、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（批号分别为：C0037、P0012S、C1062S，上海碧云天生物技术研究所）；
兔抗单克隆抗体Beclin1、p62、LC3II/LC3I、Bcl-2、Bax、Caspase-3、cleaved caspase-3、Caspase-9、cleaved Caspase-9、磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、p-PI3K、蛋白激酶 B（AKT）、p-AKT、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）、p-mTOR（货号分别为：ab62557、ab56416、ab128025、ab196495、ab53154、ab13847、ab2302、ab52298、ab2324、ab191606、ab182651、ab106693、ab192623、ab2732、ab84400，英国Abcam公司）。
1.2 细胞及细胞培养 人子宫颈鳞状癌SiHa细胞株（购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库），细胞培养于10%胎牛血清和1%青-链霉素的高糖DMEM培养基中，并放置在37℃，5% CO2恒温培养箱中。培养基每2～3 d更换1次，当需要收集细胞时，用0.25%胰蛋白酶消化。实验用细胞为对数生长期细胞。
1.3 MTT检测细胞增殖 将宫颈癌SiHa细胞接种于96孔板（100 μL/孔）孵育24h后，用不同浓度（0、0.1、0.5、1、2.5、5、10、20、40、80、120、150、200 μmol/L）花旗松素处理细胞，置于37℃，含5% CO2细胞培养箱中培养24 h，每孔加入MTT溶液50 μL，孵育4 h，吸出上清液，每孔加 150 μL DMSO，用平板摇床摇匀，用酶标仪在570 nm处检测各浓度OD值。实验重复3次，取平均值并计算药物半数抑制浓度IC50值，选择 20 μmol/L Taxifolin 为最高浓度，倍数递减确定给药浓度梯度为：20、10、5 μmol/L 进行后续实验。
1.4 CCK-8法检测细胞细胞增殖倍数 取对数生长期宫颈癌SiHa细胞，胰蛋白酶消化制成细胞悬液，以每孔4×103个细胞接种于96孔板，每孔100 μL，培养 24 h，加入 Taxifolin（0、5、10、20 μmol/L）处理24、48、72 h，于每个检测时间点（0、24、48、72 h）分别加入稀释到10%的CCK-8溶液10 μL，置于37℃，含5% CO2细胞培养箱中孵育4 h，用酶标仪在450 nm处检测吸光值，计算细胞增殖倍数。
1.5 Western blot 检 测 Beclin1、p62、LC3II/LC3I、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR 及凋亡相关蛋白表达水平 取对数生长期宫颈癌SiHa细胞接种至6孔板，置于37℃、5% CO2的细胞培养箱中，加入 Taxifolin（0、5、10、20 μmol/L）处理 24 h，处理后将细胞用磷酸盐缓冲溶液（PBS）将清洗3次，再加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液进行总蛋白提取，BCA试剂盒测定蛋白质含量；
提取等量蛋白质样品，100℃变性5 min。然后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳分离并转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%的牛血清白蛋白（BSA）室温封闭2 h后加入相应的一抗，4℃过夜孵育，次日，清洗后再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，清洗。最后加入发光液后，于凝胶成像仪进行曝光拍照，并用ImageJ软件统计灰度值计算相对表达量。GAPDH作为上样量参照，至少重复3个独立的实验。
1.6 免疫荧光检测LC3+含量 将经Taxifolin（0、5、10、20 μmol/L）处理 24 h 后的宫颈癌 SiHa 细胞接种于细胞爬片上，用PBS浸洗3次，每次3 min；
用多聚甲醛固定15 min，用PBS浸洗3次，每次3 min。0.5% Triton X-100室温通透20 min，PBS浸洗3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30 min，吸掉封闭液，加入一抗，孵育过夜，PBS浸洗，避光加入荧光二抗，孵育1 h，PBS浸洗，滴加DAPI避光孵育5 min，用含荧光淬灭剂的封片液封片，于荧光显微镜下观察采集图像。
1.7 流式检测细胞凋亡 宫颈癌SiHa细胞经Taxifolin（0、5、10、20 μmol/L）处理 24 h，胰酶消化收集各组悬浮细胞到10 mL的离心管中，每样本细胞数为 3×106/mL，1 000 r/min 离心 5 min，弃去培养液，用孵育缓冲液洗涤1次，1 000 r/min离心5 min，用100 μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育15 min，1 000 r/min离心5 min沉淀细胞孵育缓冲液洗1次，加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光并不时振动，流式细胞仪分析：流式细胞仪激发光波长用488 nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC荧光，另一波长大于560 nm的滤器检测PI。
1.8 JC-1法检测线粒体膜电位 将宫颈癌SiHa细胞接种于 6 孔板中，加入 Taxifolin（0、5、10、20μmol/L）处理24 h后用PBS清洗3次，孵育24 h，加入JC-1（5 μg/mL）室温避光反应30 min。用流式分选仪检测，记录红色和绿色荧光强度。
1.9 加入AKT激活剂SC79对SiHa细胞的影响 选择20 μmol/L剂量花旗松素处理细胞，将细胞随机分为 4 组：Control组、Taxifolin 20 μmol/L 组、SC79组和Taxifolin 20 μmol/L+SC79组。Control组不做处理，Taxifolin 20 μmol/L 组用 20 μmol/L 花旗松素处理 24 h，SC79组用 AKT激活剂 SC79处理 24 h，Taxifolin 20 μmol/L+SC79 组用 20 μmol/L 花旗松素和AKT激活剂SC79联合处理24 h。检测各组细胞凋亡、自噬及相关蛋白表达。
1.10 统计学方法 采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。正态分布计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 降低宫颈癌SiHa细胞活力 与Taxifolin 0 μmol/L浓度时相比较，Taxifolin 40、80、120、150、200 μmol/L 浓度细胞活力显著降低（P＜0.05）。结果见图1。
图1 Taxifolin不同浓度处理宫颈癌SiHa细胞24 h细胞活力的变化
2.2 抑制宫颈癌SiHa细胞增殖 与Taxifolin 0 μmol/L 组相比较，Taxifolin 10、20 μmol/L 组细胞增殖倍数显著降低（P＜0.05）。结果见图2。
图2 各组宫颈癌SiHa细胞增殖倍数的比较
2.3 诱导宫颈癌SiHa细胞自噬 与Taxifolin 0 μmol/L 组相比较，Taxifolin 10、20 μmol/L 组 p62蛋白水平显著降低（P＜0.05），Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平显著升高（P＜0.05）。结果见图3。
图3 各组宫颈癌SiHa细胞自噬蛋白Beclin1、p62、LC3II、LC3I的比较
2.4 升高宫颈癌SiHa细胞LC3+含量 与Taxifolin 0 μmol/L 组相比较，Taxifolin 10、20 μmol/L 组 LC3+含量显著升高（P＜0.05）。结果见图4。
图4 各组宫颈癌SiHa细胞LC3+含量的比较
2.5 促进宫颈癌SiHa细胞凋亡 与Taxifolin 0 μmol/L 组相比较，Taxifolin 5、10、20 μmol/L 组细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。结果见图5。
图5 各组宫颈癌SiHa细胞细胞凋亡率的比较
2.6 升高宫颈癌SiHa细胞线粒体膜电位 与Taxifolin 0 μmol/L 组相比较，Taxifolin 5、10、20 μmol/L 组线粒体膜电位显著升高（P＜0.05）。结果见图6。
图6 各组宫颈癌SiHa细胞线粒体膜电位的比较
2.7 降低宫颈癌SiHa细胞Bcl-2/Bax比值，升高cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值 与Taxifolin 0 μmol/L组相比较，Taxifolin 10、20 μmol/L 组 Bcl-2/Bax 比值显著降低（P＜0.05），cleaved Caspase-3/Caspase-3、cleaved Caspase-9/Caspase-9比值升高（P＜0.05）。结果见图7。
图7 各组宫颈癌SiHa细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9表达水平的比较
2.8 降低宫颈癌SiHa细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 比值 与 Taxifolin 0 μmol/L组相比较，Taxifolin 10、20 μmol/L 组 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 比值显著降低（P＜0.05）。结果见图8。
图8 各组宫颈癌SiHa细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平的比较
2.9 加入AKT激活剂后花旗松素对SiHa细胞的影响 与Control组相比较，Taxifolin 20 μmol/L组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 比值和P62蛋白水平显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率和Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平显著升高（P＜0.05）。SC79 组 Taxifolin 20 μmol/L 组 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值和P62蛋白水平显著升高（P＜0.05），细胞凋亡率和 Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平显著降低（P＜0.05）；
与SC79组相比较，Taxifolin 20 μM+SC79 组 p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值和P62蛋白水平显著降低（P＜0.05），细胞凋亡率和 Beclin1、LC3II/LC3I蛋白水平显著升高（P＜0.05）。结果见图9。
图9 加入AKT激活剂后花旗松素对SiHa细胞的影响
宫颈癌是全世界女性中最常被诊断出的癌症，仅次于乳腺癌，结肠直肠癌和肺癌[6]。在许多不发达国家，宫颈癌患者的5年生存率不到40%[7]。由于宫颈癌的强大增殖，侵袭和转移能力，晚期宫颈癌患者的预后仍然很差。由于化学疗法的治疗是有限且昂贵的，因此探寻治疗宫颈癌的药物是迫切的。花旗松素是维生素P族中的一种有机化合物，是一种植物黄酮类化合物，大量研究表明花旗松素对多种肿瘤具有抑制作用。本研究发现，花旗松素具有抑制宫颈癌SiHa细胞活力的作用。
抗癌药活性的主要机制之一是抑制癌细胞的生长。Li等[8]研究发现花旗松素通过抑制乳房癌细胞增殖对乳房癌具有治疗作用。Manigandan等[9]研究发现通过干预肿瘤细胞增殖和分化过程中的中的Wnt/β-catenin通路，发现花旗松素可以对结肠癌起到抑癌的作用。本文与上述结果研究一致，结果表明花旗红素具有抑制宫颈癌SiHa增殖作用。
自噬抑制某些癌细胞的生长[10]。自噬是一种主要的细胞内降解过程，参与维持机体的内环境稳态，近年来研究发现自噬功能异常与宫颈癌的发生发展以及治疗耐受等密切相关[11]。Beclin1是酵母Atg6基因在人类基因中的同源体，上调Beclin1的表达可诱导自噬的形成[12]。自噬标记蛋白p62是多泛素化结合蛋白，自噬发生缺陷可以上调p62的表达。LC3由可溶形式LC3I和脂化形式（称为LC3Ⅱ）组成。LC3Ⅱ的存在与自噬直接相关，因为LCⅡ是在自噬小体形成中募集的，细胞应激触发LC3Ⅰ缀合到磷脂酰乙醇胺以构成lapidated LC3Ⅱ，这是自噬体的一个组件，是自噬的标记物[13]，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例反应了自噬水平情况。本研究发现，花旗红素具有下调宫颈癌SiHa细胞Beclin1蛋白表达水平，上调p62、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平的作用。提示花旗红素可诱导宫颈癌SiHa细胞自噬。
细胞凋亡是细胞的程序性死亡，凋亡维持细胞的存活及死亡平衡，细胞凋亡缺陷可引起癌症自身免疫，而细胞凋亡增强则可引起退行性疾病[14]。线粒体在哺乳动物细胞凋亡的内在途径中具有重要作用。在各种类型的癌症中，凋亡抑制剂被高度表达，而凋亡启动子大多被灭活，导致一定程度的耐药性。因此，通过调调控在癌细胞中的细胞凋亡的正常响应的再活化是希望的治疗方法[15]。Zhou等[16]研究发现花旗红素通过诱导凋亡，细胞周期停滞和抑制PI3K/AKT/mTOR途径来抑制瘢痕细胞癌的生长。符小玲等[17]研究发现花旗松素可以时间和浓度依赖性的方式抑制体外培养的人非小细胞肺癌细胞增殖并促进其凋亡。本文与上述结果研究一致，结果表明花旗红素具有促进宫颈癌SiHa细胞凋亡的作用。
线粒体膜电位是由存在于线粒体内膜的质子泵将基质内的质子泵入外室所形成的横跨线粒体内膜的线粒体膜电位，其为维持线粒体进行氧化磷酸化、产生三磷酸腺苷、保持线粒体功能的基础[18]。Xiao等[19]研究发现花旗松素通过抑制线粒体膜电位下降，减轻ROS从而保护H9C2细胞的氧化应激损伤。本研究发现，花旗红素具有升高宫颈癌SiHa细胞线粒体膜电位的作用。
细胞衰老是指细胞脱离细胞周期并不可逆地丧失增殖能力后进入的一种相对稳定的状态，是正常细胞的必然归宿。而越来越多的研究发现，肿瘤细胞往往具有衰老障碍而表现出无限增殖的能力。在多种衰老细胞中，某些抑癌基因的过表达会引起细胞进入衰老程序，细胞绕过衰老途径是其永生化及癌变进展的必要条件。本研究发现，花旗红素具有降低宫颈癌SiHa细胞Bcl-2/Bax mRNA水平，升高Caspase-3、Caspase-9水平的作用。提示花旗红素可抑制宫颈癌SiHa细胞衰老。
磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K/Akt/mTOR）信号传导通路是哺乳动物细胞内重要的信号传导通路之一，它通过影响其下游多种效应分子的活化状态，发挥抑制细胞凋亡、促进增殖的作用。Zhou等[16]研究发现花旗松素通过诱导凋亡，细胞周期停滞和抑制PI3K/AKT/mTOR途径来抑制瘢痕细胞癌的生长。本研究发现，花旗松素具有降低宫颈癌SiHa细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值的作用，且加入PI3K/AKT信号通路激活剂SC79可逆转花旗松素对SiHa细胞凋亡、自噬及PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响。提示花旗松素通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化调控宫颈癌SiHa细胞的生物学行为。
综上所述，花旗松素对宫颈癌SiHa细胞具有抑制增殖、衰老，促进凋亡、自噬，升高线粒体膜电位的作用，这可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活化实现的，提示花旗松素可用于临床治疗宫颈癌的潜力，为临床治疗提供实验依据。但花旗松素难溶于水，导致生物利用率低，限制了其在医药和临床上的使用，下一步计划研究提高花旗松素的生物利用率。
猜你喜欢红素膜电位花旗咏费城自由钟东坡赤壁诗词(2019年5期)2019-11-14pH玻璃电极膜电位的形成及其应用教育教学论坛(2019年19期)2019-06-17紫菜掉色，是染出来的？恋爱婚姻家庭·青春(2019年2期)2019-02-26蔷薇诗潮(2018年5期)2018-08-20花旗預測2017年賭收2660億澳门月刊(2017年12期)2017-12-15小续命汤有效成分组对脑缺血/再灌注大鼠恢复早期脑线粒体的保护作用研究中国中药杂志(2017年11期)2017-06-22红酵母红素对氧化受损PC12细胞的保护作用食品工业科技(2014年23期)2014-03-11西红柿怎么吃最健康小星星·阅读100分(低年级)(2009年12期)2009-01-25