苑 丽 艳， 姜 鹏 飞，2， 祁 立 波，2， 傅 宝 尚，2， 林 松 毅，2
(1.大连工业大学 食品学院， 辽宁 大连 116034；
2.大连工业大学 国家海洋食品工程技术研究中心， 辽宁 大连 116034 )
高尿酸血症(HUA)的发生受血尿酸(UA)水平的调控，当机体内嘌呤代谢紊乱，肾脏UA排泄不足引起体内UA浓度异常增加，高于416 μmol/L 时，即为高尿酸血症[1]，会导致痛风、炎症反应及其他代谢性疾病，心血管疾病、急慢性肾病等的患病概率增加[2-3]。由于生活水平的提高以及人们饮食习惯的变化等，全球越来越多的人患上HUA，且患者呈现明显的低龄化趋势[4]。目前诊治HUA和痛风的有效药物如别嘌呤醇(AP)等均可能导致患者出现严重的恶性反应，甚至死亡[5]。因此寻找具有抗HUA作用且更加安全的活性物质意义重大。
玉米花丝资源丰富、来源广阔，含有多种有益的生物活性成分，在民间常被煮水后饮用治疗肾炎、高血压、糖尿病等疾病，或与其他药物配伍使用治疗痛风[6]。多糖是其最主要的活性成分[7]。研究表明，玉米花丝多糖在利尿、抗糖尿病、降血脂等方面均表现出良好的药理作用，是一种潜在的功能制剂[8-9]。然而，关于玉米花丝多糖对HUA的作用尚未有明确的报道。
本实验以玉米花丝为原料，从中分离纯化得到一种中性多糖，利用氧嗪酸钾(PO)构建HUA小鼠模型，以AP为阳性药物，依据血尿酸(UA)浓度、血清和肝脏黄嘌呤氧化酶(XO)活性、血肌酐(Cr)浓度以及肝脏、肾脏病理学变化考察其体内降尿酸活性，初步分析作用机制，以期丰富降尿酸活性成分组成，为玉米花丝资源的充分利用提供依据。
1.1 原料与仪器
干玉米花丝，品种为辽育606，秋季收集自大连仟和市场。清洁级雄性昆明种小鼠(ID SCXK2020-0001)，体重(20±2) g，8周龄，辽宁长生生物科技有限公司；
氧嗪酸钾，麦克林有限责任公司；
别嘌呤醇，阿拉丁试剂(上海)有限公司；
血尿酸、黄嘌呤氧化酶、血肌酐试剂盒，南京建成生物工程研究所；
BCA试剂盒，北京索莱科技有限宝公司；
DEAE-52纤维素，BXD公司。
CXG-1F层析柜，上海青浦沪西仪器厂；
SY-5000旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；
CR22N高速冷冻离心机，日立工机株式会社；
10ND冷冻真空干燥机，宁波新芝生物科技有限公司；
Infinite M200多功能酶标仪，瑞士TECAN公司。
1.2 方 法
1.2.1 玉米花丝中性多糖的制备
1.2.1.1 粗多糖的提取
按照Chen等[10]的方法提取粗多糖。精确称取1 g干玉米花丝，利用热水浸提法在料液比1∶100、80 ℃提取90 min。8 000 r/min离心水提液20 min，保留上层溶液，蒸发浓缩，添加乙醇溶液，终体积分数为70%，4 ℃下静止24 h。加入蒸馏水以重新溶解沉淀，冻干后获得水提玉米花丝粗多糖(CCSP)。
1.2.1.2 脱色脱蛋白及透析处理
CCSP经过氧化氢脱色，以体积比1∶0.2添加Sevag溶液(氯仿与正丁醇体积比5∶1)，以去除其中的蛋白质类物质，重复6次，合并所得液体，浓缩去除有机试剂[11]。经流动水和蒸馏水分别透析处理2 d，冻干样品。
1.2.1.3 DEAE-52柱层析
将预先吸水充分溶胀、NaOH/HCl/NaOH溶液分别浸润30 min，用蒸馏水不断冲洗直至中性的DEAE-52纤维素填入规格为Φ3.0 cm×60 cm 的纯化柱中。将脱色脱蛋白并透析处理的CCSP样品重新溶解后装入该纯化柱中，以1 mL/min 的体积流量连续通入蒸馏水，直至无多糖组分被洗脱。该中性多糖组分命名为NCSP，苯酚-浓硫酸法测定其中的多糖类物质[12]。
1.2.2 动物饲养
雄性昆明种小鼠在温度(22±2) ℃、相对湿度(50±15)%、正常暗/光循环(12 h/12 h)条件下适应至少一周，其间自由进食及饮水。
1.2.3 高尿酸血症模型小鼠的构建
根据Zhang等[13]的方法并稍做修改后建立HUA小鼠模型，造模药为PO，阳性药为AP。将小鼠随机分为6组：空白对照组，模型对照组，阳性对照组，NCSP低、中、高剂量组(10、20、40 mg/kg)。正常对照组在7 d内均接受生理盐水处理，其余各组用250 mg/kg的PO处理以诱导HUA。1 h后，正常和模型对照组用生理盐水处理，阳性对照组、NCSP 3个给药组各自给予5 mg/kg的AP和相应浓度的NCSP。处理6 d后，在最终给药处理前12 h将食物撤出。灌胃1 h后，于眼球处采血，检测血液相关指标。颈椎脱臼法处死实验动物，当即分离肝、肾、脾、心并称重。其中一部分肾、肝脏样本处理后进行病理学研究。另取部分肝脏组织用以评价肝脏XO活性。
1.2.4 高尿酸血症小鼠生化指标的测定
依照相应试剂盒的指示说明，评价血UA、Cr水平及血清和肝脏XO活性。
1.2.4.1 血清UA的测定
将5 μL蒸馏水或UA标准溶液(400 μmol/L)或小鼠血清样品与250 μL试剂1混合均匀，37 ℃下保持静止10 min而后检测各样品在510 nm的吸光度。血清尿酸浓度按式(1)计算。
(1)
式中：Ac为小鼠血清样品的吸光度；
As为UA标准溶液的吸光度；
A0为空白对照(蒸馏水)的吸光度；
cs为UA标准溶液浓度，μmol/L。
1.2.4.2 血清和肝脏XO活性的测定
向100 μL匀浆样品中依次加入1.0 mL试剂1、0.05 mL试剂2、0.2 mL试剂3和0.02 mL试剂4，37 ℃水浴20 min。加入1 mL试剂5摇匀后检测各反应液在530 nm的吸光度。血清XO酶活单位的定义：每毫升血清(浆)每分钟催化产生1 nmol尿酸为一个酶活力单位(U/L)。肝脏XO酶活单位的定义：每毫克组织蛋白每分钟催化产生1 nmol尿酸为一个酶活力单位(U/g)。
(2)
式中：A′c为小鼠血清样品的吸光度；
A′0为空白对照(蒸馏水)的吸光度；
V为反应溶液总体积，L；
Vc为样品体积，L；
t为反应时间，20 min；
12.6×10-3为尿酸摩尔吸光系数与孔板光径的乘积，mL/nmol。
(3)
式中：A″c为小鼠肝匀浆上清样品的吸光度；
A0为空白对照(蒸馏水)的吸光度；
V″为反应溶液总体积，L；
V″c为样品体积，L；
t为反应时间，20 min；
12.6×10-3为尿酸摩尔吸光系数与孔板光径的乘积，mL/nmol；
cc为肝匀浆上清的蛋白浓度，由BCA试剂盒测定。
1.2.4.3 血清Cr的测定
将6 μL蒸馏水、Cr标准溶液(442 μmol/L)、小鼠血清样品分别与180 μL试剂1混合均匀，37 ℃下温 育5 min，在546 nm处测定吸光度(A1)。继续添加180 μL试剂2，测定吸光度(A2)。血清Cr浓度按公式(4)计算。
(4)
式中：Ac1、Ac2为小鼠血清样品的吸光度，As1、As2为Cr标准溶液的吸光度，k为稀释因子，A01、A02为空白对照(蒸馏水)的吸光度。
1.2.5 数据统计分析
实验结果表示为(均值±SD)。利用单因素方差分析进行数据处理与结果分析，确定统计学差异。利用GraphPad Prism 8.3.0软件进行统计图绘制。
2.1 玉米花丝中性多糖对高尿酸血症模型小鼠生化指标的影响
2.1.1 对高尿酸血症小鼠血尿酸浓度的影响
如图1(a)所示，PO诱导的HUA模型小鼠血清UA浓度与未经药物处理的正常小鼠相比显著增加，二者间存在明显差异(P<0.001)，表明HUA小鼠模型成功建立。与模型对照组相比，阳性药物AP和NCSP低、中、高剂量组血清UA水平均显著下降，分别下降66.67%、45.68%、50.51%和57.56%(P<0.001)，表明NCSP拥有抗HUA的能力，且活性呈剂量依赖。尿酸盐是血浆中主要的抗氧化剂之一，其极低水平长期存在极有可能引发其他疾病，且其与死亡率之间存在U型曲线关系[14-15]。本实验中各剂量的NCSP均未将血清UA降至极低水平，其值与正常对照组接近，提示NCSP具有作为功能食品成分降低血清UA水平、治疗HUA的应用潜力。
2.1.2 对高尿酸血症小鼠血清和肝脏黄嘌呤氧化酶活性的影响
XO是产生UA的关键酶，其活性升高会引起UA水平的升高，抑制该酶活性是阻断体内UA过量合成，并在临床上治疗痛风的有效途径[16]。为了探究NCSP降尿酸作用机制，对XO活性进行测定。如图2(b)和图2(c)所示，模型对照组小鼠血清和肝脏中的XO活性均明显提高(P<0.01)，分别达到9.40 U/L和2.90 U/g，说明经氧嗪酸钾诱导后，在嘌呤分解代谢的最后步骤中负责将次黄嘌呤分解成黄嘌呤、最终产生UA的XO活性被激活并提高。与图1(a)所示PO导致HUA小鼠血清UA浓度明显增加的结果一致。NCSP组血清和肝脏XO活性均随剂量增大而表现出更大程度的减弱，说明NCSP对XO活性具有抑制作用。其中血清XO活性在中、高剂量时分别降低了14.47%(P<0.05)和19.89%(P<0.01)；
肝脏XO活性在中、高剂量时分别降低了6.90%和7.24%。提示NCSP能够以降低XO活性阻碍UA产生的方式表现出抗HUA的能力。
(a) 血清尿酸
2.1.3 对高尿酸血症小鼠血肌酐浓度的影响
UA被认为是慢性肾脏疾病发展的潜在危险因素，因此本研究探讨NCSP对小鼠肾脏功能的影响。在实际应用中，血清Cr浓度常用来体现肾功能状况[17]。如图1(d)所示，相较于空白对照组，模型对照组小鼠血清Cr水平显著升高。中剂量和高剂量组能够更好地降低HUA小鼠的血清Cr水平，分别降低了20.07%(P<0.05)和30.02%(P<0.01)，作用效果比阳性药物更好。提示NCSP具有改善肾损害的能力，可能与肾UA清除率增加有关[5]。
2.2 玉米花丝中性多糖对高尿酸血症模型小鼠病理组织学的影响
2.2.1 对高尿酸血症小鼠肾脏组织的影响
肾脏在HUA发生中的作用巨大，70%的UA由肾脏排出，其发生病变会造成UA直接排泄不足，增加血液UA水平，引起HUA[18-19]。如图2所示，空白对照组小鼠肾组织清晰完整，未见病理损伤。模型对照组小鼠肾脏组织形态被破坏，肾小球严重萎缩，肾小管扩张，管腔不规则，说明PO引起了严重的肾损伤。NCSP治疗后，小鼠肾脏结构均有不同程度的恢复，其中高剂量组小鼠的肾脏组织恢复效果更好，该结果与其对UA和Cr浓度的影响一致。说明NCSP通过保护HUA小鼠的肾脏功能，增加肾UA排泄量，减少了模型小鼠血清UA含量。
(a) 空白对照组
2.2.2 对高尿酸血症小鼠肝脏组织的影响
如图3所示，与空白对照组相比，各剂量组小鼠肝组织均不存在变性、肿胀等其他病理学变化，说明NCSP对小鼠无毒性作用。
(a) 空白对照组
2.3 玉米花丝中性多糖对高尿酸血症模型小鼠生理指标的影响
2.3.1 对高尿酸血症小鼠脏器系数的影响
不同剂量多糖对高尿酸血症模型小鼠脏器系数的影响如表1所示。结果表明，多糖对小鼠的肝、肾、心和脾脏系数的影响不存在统计学差异(P>0.05)。说明玉米花丝多糖并未引起小鼠脏器质量明显变化，安全可靠。
表1 不同剂量NCSP对高尿酸血症模型小鼠脏器系数的影响
2.3.2 对高尿酸血症小鼠体重的影响
不同剂量多糖对高尿酸血症模型小鼠体重的影响如表2所示。结果表明，小鼠体重与对照组相比差别不大(P>0.05)。实验期间小鼠无死亡现象，证明3种剂量的玉米花丝多糖对小鼠健康没有显著影响。
表2 不同剂量NCSP对高尿酸血症模型小鼠体重的影响
通过DEAE-52纤维素柱层析法实现了玉米花丝多糖类化合物的分离纯化，研究了其对PO所致HUA模型小鼠的影响。结果表明，纯化的NCSP显著降低HUA模型小鼠体内UA浓度。同时，血清Cr水平显著降低。肾脏组织病理学分析证明NCSP具有较好的减轻肾脏损害的能力。对血清和肝脏中XO活性进行测定，得到NCSP降尿酸作用机制之一是通过抑制该酶活性减少UA产生，从而表现出抗HUA的作用。玉米花丝中性多糖的抗高尿酸血症作用与其抑制黄嘌呤氧化酶活性、减少血尿酸生成、保护肾功能损害促进血尿酸排泄有关。
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