杜倩倩，杨烨浩，徐天瑞，王忠巧，向 诚
(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500；
2.云南省高校靶点药物筛选与利用重点实验室，云南 昆明 650500；
3. 彝良县天麻产业开发中心，云南 昭通 657600)
天麻为兰科(Orchidaceae)植物天麻(GastrodiaelataBl.，G.elataBl.)的干燥块茎，腐生于海拔1 950～3 000 m 的疏林下，在日本、朝鲜、印度等均有分布，我国主产于云南、贵州、四川等地[1].根据古代本草文献的考证，天麻道地产区包括现今陕西、四川、山东、河南、湖南、湖北、山西、安徽、甘肃、青海等省[2].天麻作为我国常用名贵中药材之一，具有熄风止痉、平肝阳、祛风通络之功效，主治急慢性惊风、眩晕、头痛、肢麻等.现代药理研究表明，天麻具有镇静、镇痛、抗惊厥、改善学习记忆等作用[3].
《中华人民共和国中医药法》[4]收载的道地药材是指经过中医临床长期应用优选出来的，产在特定地域，与其他地区所产同种中药材相比，品质和疗效更好，且质量稳定，具有较高知名度的中药材.黄璐琦等[5]研究指出，道地性是道地药材所具有的各种专属性状的总称，从现代科学角度看，道地性的形成原因主要包括药材本身的品种、生长环境、种植与加工技术，这些因素会导致药材的有效成分含量发生波动，继而影响临床疗效.
2020版《中华人民共和国药典》[6]和天麻国际药材标准《中医药-天麻药材》[7]从天麻的品种基源、外观性状、显微鉴别、薄层色谱鉴别、水分、总灰分、SO2残留、浸出物、有效成分的含量测定方法和限度、HPLC-UV对照特征图谱以及重金属和农残限度等规定了其质量的合格标准.中华中医药学会2019年发布的团体标准《道地药材第121部分：天麻(T/CACM 1020.121-2019)》[8]，从品种基源和形态特征鉴别、品种和产地历史沿革、道地品种和产区分布、产地生境特征进行了天麻道地性的总结.按1984年颁布的《七十六种药材商品规格标准》[9]将天麻的商品规格依据干货的个头大小、有无破损、空心和虫蛀分为四级.综上，中国药典和国际药材标准都收载了天麻的合格标准，并不能显示优劣分级；
团体标准主要是对天麻道地产区和品种基源从外观性状上进行鉴别，且仅提及了天麻的两种变型；
商品规格是按性状进行分级，上述标准分类都未能够结合报道的天麻有效成分指标鉴别优质道地药材，评价天麻的品质.因此，笔者通过对天麻近20年相关文献进行整理，基于与药效相关的有效成分，从天麻品种、产地、加工与炮制、种植采收等方面，结合多种数理统计方法分析影响天麻道地性的形成原因，以期为天麻品质评价、道地性成因提供参考.
本研究选用“中国知网”“美国国立生物技术信息中心”作为数据来源，以“天麻”作为关键词进行检索，文献来源类别为期刊和论文，检索时间为2000—2021年，获取相关文献192篇，最终选用文献46篇.采用Excel 2016对纳入文献进行整理统计.
2.1 不同品种天麻有效成分分析
天麻根据植株形态、块茎形状、花色等特点，可分为红天麻(G.elataBl.f.elata.)、绿天麻(G.elataBl.f.viridisMak)、乌天麻(G.elataBl.f.glaucaS.Chow)、黄天麻(G.elataBl.f.flavidaS.Chow)以及松天麻(G.elataBl.f.albaS.Chow)[1].此外，王绍柏等[10]用宜昌红天麻S2自交系与云南乌天麻S4自交系进行正反交培育出了鄂天麻一号(乌红杂交天麻)和鄂天麻二号(红乌杂交天麻).
文献分析显示[11-17]，乌天麻、红天麻、黄天麻、绿天麻、杂交天麻(将鄂天麻一号和二号均列为杂交天麻)等5种天麻的有效成分含量差异较大，其主要包括天麻素(Gastrodin，Gas)、巴利森苷A(Parishin A，PA)、巴利森苷B(Parishin B，PB)、巴利森苷C(Parishin C，PC)、对羟基苯甲醇(p-Hydroxybenzylalcohol，HA)、对羟基苯甲醛(p-Hydroxybenzaldehyde，HB)(见图1).其中，黄天麻的Gas含量相对较高，红天麻和杂交天麻的Gas含量较低；
HA含量除杂交天麻外整体分布较均；
乌天麻HB含量较高，其次为红天麻和黄天麻；
各品种的PB、PC含量较分散，品种间巴利森苷类总含量差异较小.
(a) 5个天麻品种Gas含量分布 (b) 5个天麻品种PA含量分布 (c) 5个天麻品种PB含量分布
(d) 5个天麻品种PC含量分布 (e) 5个天麻品种HA含量分布 (f) 5个天麻品种HB含量分布图1 5个天麻品种中Gas、PA、PB、PC、HA、HB的含量分布Fig.1 Content distribution of Gas,PA,PB,PC,HA,HB in 5 G.elata Bl. cultivars
2.2 不同地区产天麻有效成分分析
天麻在我国已有2000多年应用历史，从魏晋时期就以山东泰安及其周边地区为道地产区并延续至明清，近现代由于朝代更替和人文与自然环境的变化，其道地产区发生较大变化.文献分析表明[11,18-25]，云南、贵州、四川、陕西、湖北、安徽等天麻主流产区中Gas的含量差异较小，HA含量差异较大，见图2.进一步对6个主流产区天麻中各有效成分的平均含量分析可知，产地因素对天麻中有效成分含量影响较为显著，尤以Gas、PA、PB较为明显，见图3.云南、贵州、四川产天麻中的Gas和PA含量较低，PB含量较高.HA含量总体较为稳定，而安徽产天麻中的HA平均含量最低.
(a) 6个主流产区Gas含量分布 (b) 6个主流产区PA含量分布 (c) 6个主流产区PB含量分布
(d) 6个主流产区PC含量分布 (e) 6个主流产区HA含量分布 (f) 6个主流产区HB含量分布图2 6个天麻主流产区中Gas、PA、PB、PC、HA、HB的含量分布Fig.2 Content distribution of Gas,PA,PB,PC,HA,HB in 6 popular G.elata Bl. producing areas
(a) 6个主流产区天麻有效成分的平均含量热图 (b) 6个主流产区天麻有效成分的平均含量走势图图3 6个主流产区产天麻中有效成分平均含量对比Fig.3 Comparison of the average content of active ingredients in G.elata Bl. from 6 popular producing areas
2.3 不同加工炮制天麻有效成分分析
药材的品质除药材品种外，合理的加工炮制也是必不可少的.天麻的产地加工炮制是品质特征形成的关键，直接影响到临床疗效，甚至还影响到整个天麻产业的发展[5].据本草记载，天麻的产地加工方法主要有曝干、净制、酒浸、煨、煮和蒸6种[16].此外，为了让天麻更好地交易和流通保存，还会对天麻进行硫熏[26-28].通过对天麻加工炮制工艺等文献调研表明[16,29-39]，不同的加工炮制方式对天麻有效成分含量的影响较大，见图4，相比于生品，HA和HB含量降低，蒸制块和煮制块能够增加Gas、PA、PB、PC含量，煮制块的效果普遍强于蒸制块.
(a) 不同加工炮制天麻Gas含量分布 (b) 不同加工炮制天麻PA含量分布 (c) 不同加工炮制天麻PB含量分布
(d) 不同加工炮制天麻PC含量分布 (e) 不同加工炮制天麻HA含量分布 (f) 不同加工炮制天麻HB含量分布图4 不同加工炮制天麻中Gas、PA、PB、PC、HA、HB的含量分布Fig.4 Content distribution of Gas,PA,PB,PC,HA and HB in G.elata Bl. processed by different methods
2.4 天麻种植方式分析
天麻为腐生草本，地下具根状茎，为典型的异养植物.天麻的种植需“两菌一种”，即萌发菌(Mycena)、蜜环菌(Armillariamellea(Vahl) P. Kumm.)和天麻种.天麻种子发芽期需依靠小菇属萌发菌侵染以提供营养，生长期则主要通过共生的蜜环菌提供养分[40]，不同的天麻种直接影响到天麻的产量和品质，天麻的生长周期见图5.
图5 天麻的生长周期Fig.5 The growth cycle of G.elata Bl.
为防止天麻退化，提高天麻产量，冉砚珠等[41]从12种可供天麻种子发芽的萌发菌菌株中筛选出最优良的菌株——紫萁小菇(Mycenapurpureofusca).此后，研究者先后报道了兰小菇(Mycenaorchudicola)[42]，开唇兰小菇(Mycenaanoectochula)[43]和石斛小菇(Mycenadendrobii)[44]，目前应用最广泛的是紫萁小菇和石斛小菇.近年来，由于环境气候的变化，导致很多产区外来萌发菌与本地天麻种子的亲和性不稳定，严重影响了天麻有性栽培的产量，所以，越来越多的研究者开始寻找本地的优良萌发菌株用于天麻的种植生产[45-47].
蜜环菌是世界性分布的病原菌，已经报道的我国分布的蜜环菌(见表1)以互交不育群(即生物种)为基础，较为科学客观地分为14种，统称中国生物种(Chinese Biological Species,CBS)[48].
表1 分布在中国的蜜环菌Tab.1 A. mellea species distributed in China
季宁、刘天睿、王永等人[49-51]以“三下窝”方式，采用不同地区分离的高卢蜜环菌伴栽仿野生栽培，结果见表2，即使是同种蜜环菌，但在不同地区使用会显著影响天麻的产量以及天麻有效成分的含量.
表2 不同地区分离的高卢蜜环菌伴栽天麻的产量以及Gas与HA的含量Tab.2 Yield and Gas and HA content of G.elata Bl. grown with A.gallica isolated from different regions
续表2
刘金美等[52]研究表明，乌天麻最佳采收时间为每年11月以后，此时天麻中可溶性浸提物、天麻素含量可达最高(0.53%)；
翌年3月后，天麻素含量大幅降低.因此，对文献报道的采收期为10月、11月和翌年3月的云南乌天麻数据[50,52]进行汇总，统计如图6所示.天麻中天麻素的含量呈现先升高再降低的趋势，11月采收天麻的天麻素含量显著高于10月和翌年3月，该结果与刘金美等的结论相符.
注：与10月和翌年3月比较，*P<0.05图6 3个采收期天麻的Gas含量比较Fig.6 Comparison of Gas content of G.elata Bl. in three harvesting periods
2.5 天麻道地性形成主因素分析和聚类分析
选取影响天麻道地性的主要因素，包括品种(乌天麻、红天麻、黄天麻、绿天麻、杂交天麻)、产地(云南、贵州、四川、陕西、湖北、安徽)、加工炮制(生品、蒸制块、煮制块、硫熏、未硫熏)这16种因素水平与天麻有效成分(Gas、PA、PB、PC、HA、HB)进行主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)，将文献中的原始数据归一汇总如表3.将表3导入SPSS 23.0软件中，对影响天麻成分的因素水平进行打分排列和综合评分，最终提取出影响天麻成分的最主要原因.
表3 16种因素水平下天麻6种有效成分的平均含量(mg/g)Tab.3 Average content of 6 effective components of G.elata Bl. at the level of 16 factors (mg/g)
续表3
当主成分个数达到2时，累积贡献率达76.802%，即2个主成分代表了16种影响天麻成分因素的76.802%，故确定主成分个数为2个，见表4.由表5成分矩阵可知，第一主成分主要反映了Gas、PA、PB、PC等因素的信息，即成分1代表苷类成分；
第二主成分主要反映了HB的信息，即成分2代表酚类成分.
表4 特征值、方差贡献率、累计贡献率Tab.4 The eigenvalue, the variance contribution rate, and the cumulative contribution rate
表5 成分矩阵Tab.5 The composition matrix
将16种因素进行标准化另存为变量，以2个主成分所对应的特征值占所提取主成分总的特征值之和的比例作为权重，计算主成分综合模型，根据主成分综合模型即可算出综合主成分值.其综合评价函数为Y=3.478/(3.478+1.130)*Y1+1.130/(3.478+1.130)*Y2，按综合评价函数计算出的不同因素各主成分值、综合成分得分及排序，见表6.所有因素中煮蒸初加工最为显著，分别位列第一和第二，煮制块对天麻成分综合影响大于蒸制块；
品种对天麻有效成分含量影响大小的排序为乌天麻>绿天麻>红天麻>杂交天麻；
产地普遍影响天麻品质，所以天麻的生长环境就显而易见的重要.
表6 各因素标准向量主成分值、综合成分得分、排序Tab.6 Standard vector principal component value of each factor, comprehensive component score, ranking
各因素的PCA得分图见图7，其中红天麻、杂交天麻、生品和硫熏4种天麻均落在第四区间，与2个主成分呈负相关，即对2个主成分的贡献率较低，对天麻品质的影响较小；
其他组别天麻均落在主成分1的正向区间或主成分2的正向区间，对天麻品质的影响较大.
图7 主成分分析PCA得分图Fig.7 PCA scores for 16 factors on Principal Component 1 and Principal Component 2
因主成分分析会损失样本的信息，故本研究还利用SPSS 23.0对样本的相似程度进行聚类，将多个因素聚合.依据天麻有效成分采用质心聚类法进行个案Q型系统聚类分析，依据图8聚类谱系图，在平方欧式距离为4时，14个因素样本被分为5类，第一类聚集了云南、安徽、四川、贵州、陕西、湖北、绿天麻、乌天麻以及蒸制块天麻，第二类聚集了红天麻和杂交天麻，硫熏、生品和煮制块天麻各自成类，这与主成分分析的分结果一致.在平方欧式距离为17时，煮制块仍然自成一类，其余天麻聚为一类，说明煮制块优势突出，也与主成分分析中煮制块综合得分位列第一相一致.
图8 聚类分析谱系图Fig.8 Cluster analysis genealogy diagram
2.6 模糊概率法对天麻道地性形成原因进行综合评价
评价天麻品质好坏的指标较多，如Gas和HA含量、外观性状、商品规格以及临床药效等指标，各项指标之间相互交错.因此，若仅从直观定性或者从单一指标分析评价难以得出合理的结果.笔者基于天麻有效成分，采用模糊概率学对其道地性形成原因进行综合分析.模糊概率值的大小全面地反映了文中道地性因素水平的优劣，其总和值越大，因素的综合表现越优，这样依据因素模糊概率值的大小就可以得出因素优劣次序[16].
文中指标隶属度计算参考黄振瑞等[53]的方法进行.指标权重计算和综合指标模糊概率计算参考王国印[54]的方法进行.表3数据导入Excel 2016后进行统计分析.
隶属度计算公式为：
(1)
式中：i=1,2,…,n；
j=1,2,…,m；
n为评价指标，m为待评因素数；
μij表示第j因素第i成分值对于最大值(ximax)的隶属度.本研究样品各成分指标录属度计算结果见表7.
表7 不同天麻样品各成分指标的隶属度Tab.7 The degree of membership of each component index of different G.elata Bl. samples
将表4数据导入SPSS 23.0软件中，计算单项指标之间的相关系数结果见表8.
表8 天麻各成分指标间相关性Tab.8 Correlation between the components of G.elata Bl.
利用各成分指标的相关系数确定各成分指标的权重值，根据公式(2)得到单项成分指标在样品综合成分指标中的权重见表9.
表9 天麻样品各成分指标的权重系数Tab.9 Weight coefficients of each component index of G.elata Bl. samples
权重系数(Pi)计算公式：
(2)
将表9中的权重系数Pi代入公式(3)获得天麻道地性因素的模糊概率，见表10.煮制块的综合评分为0.709，位列第一，蒸制块的综合评分为0.637，位列第二，煮制块的综合品质优于蒸制块；
云南产天麻的综合评分为0.496，位列第三，陕西的综合评分为0.492，位列第四，说明云南和陕西产天麻品质较好.
表10 天麻16个道地性因素的模糊概率及排序Tab.10 Fuzzy probability and ranking of 16 authentic factors of G.elata Bl.
模糊概率P(Aj)计算公式：
P(Aj)=∑A(μij)*Pi
(3)
式中：P(Aj)表示第j个因素的模糊概率值，A是某一因素的模糊集合.
随着人们对健康要求的提高和对中药品质的重视，中药材的质量控制逐渐从合格标准向优质标准进步，对品质越来越重视.药材的道地性是中医对药材品质综合判断的重要指标，代表了优质中药材.然而，历代中医药学家对中药的道地性多集中于产地和性状，具有一定的模糊性和主观性，2019年的团体标准就仅对中药道地性进行了概括，并未量化.
近现代以来，天麻的引种、杂交和市场掺杂等现象的出现，对道地药材造成了严重冲击，单纯以性状指标不足以识别道地天麻.因此，对道地药材的化学成分和分子生物学基础的研究越来越受到重视，DNA分子标签、建立道地药材指纹图谱等新技术被用来探索对道地药材质量进行科学客观的评价.然而,天麻的质量控制研究多见于化学指纹图谱和单一因素的研究，如樊启猛等[20]进行了不同产地5种天麻成分的含量测定；
吴佳新等[14]采用高效液相色谱法研究了不同品种天麻的天麻素含量比较，但道地性形成的原因是多因素且相互影响的，评判标准也有性状、化学成分、功效等不同角度，如何从复杂因素中提取影响天麻化学品质的道地性原因，至今未见相关的研究报道.故本研究结合天麻的有效成分，对天麻道地性进行科学全面的研究和分析，希望能进一步深入说明天麻的道地性的形成原因.
在天麻化学品质评价研究中，本研究选择了天麻中具有广泛生理活性和药理活性的6个化合物.药理研究表明，Gas具有镇静催眠、抗癫痫、镇痛、保护神经元细胞和抗氧化、抗炎、增强机体免疫力等作用，是天麻中含量最高的有效单体成分[55]；
巴利森苷类可代谢成天麻素类衍生物，具有改善学习记忆的作用，且效果比天麻素单体更强[56-60]；
HA具有镇静、催眠、抗惊厥、抗抑郁、改善记忆力、抗炎、抗肿瘤、抑制血小板凝集以及脑缺血保护作用[61-66]；
HB可抗血小板聚集和保护血脑屏障[67-68].天麻成分复杂，发挥作用往往不是单一成分，本研究为基于多种有效成分的综合评价，因此，笔者认为控制中药质量标准的也并不仅是某个特殊成分或标准成分，若仅以中国药典标准的Gas和HA指标为评价依据，不足以判断道地天麻.
研究结果表明，天麻的初加工和产地来源对天麻的有效成分产生极其重要的影响，初加工是影响天麻品质的最主要因素，经过煮蒸的天麻在天麻素和巴利森苷类成分上与生品相比均有明显的增加，品质明显提升，其中煮制块尤甚.唐文文等[69]同样认为煮蒸会对天麻产生有利影响，同时以为煮制相较于蒸制会造成天麻素的流失，该研究的局限性即是在单一因素下评价了Gas和HA的含量，而本研究是在多指标多样本多维度进行分析，发现煮制块更能提升天麻的综合品质.产地因素对天麻中有效成分含量影响较为显著，以Gas、PA、PB较为明显.主流产区中云南天麻品质最好，在主产地中位列第一，这得益于云南独特的地理、气候、生态及植被环境，也与云南的“仿野生栽培”技术和采用的“两菌一种”息息相关.此外，不同品种间巴利森苷类总含量差异较小，但Gas、HA、HB有效成分含量差异较大，这就为优良天麻种的选择提供了参考.乌天麻和绿天麻综合品质较好，云南乌天麻种植面积广，可能这是云南天麻模糊概率高，品质好的原因之一.周碧乾[16]通过模糊概率认为绿天麻药用价值最高，与本研究的结论相一致.尽管绿天麻的模糊概率大于乌天麻，但目前绿天麻的种植率和产量较低，相比于种植面积较广的乌天麻优势不突出，因此，相较之下乌天麻综合评价较优.天麻的产量和品质会因种植采收的不同有一定差异，是基于当地自然环境开发优良菌株和天麻种用于生产种植，需要因地制宜，提升综合品质，保证天麻质量.
本研究结合中医药理论和文献计量学，基于天麻的有效成分，从品种、产地、加工和种植采收深入分析了道地天麻的成因，多维度辩证分析天麻的道地性.对6个主流产天麻中各有效成分的平均含量分析可知，加工炮制为影响天麻品质的最主要因素，其中煮制块能提高天麻品质；
各个产地中，云南产天麻综合品质较优；
多个天麻品种中，乌天麻品种最优.