蒋 焜，杜 洋，许立哲，宁金卓
(武汉大学人民医院 泌尿外科,湖北 武汉 430060)
Dickkopf相关蛋白3(dickkopf 3,DKK3)是一种分泌性糖蛋白，属DKK蛋白家族成员，其定位于染色体11p15.1上的长47.1kb的DKK3基因编码，由350个氨基酸组成，分子量为38 000 ku，具有N端信号肽以及包含两个被可变的接头区分开保守的富含半胱氨酸结构域，分别是Cys-1和Cys-2[1]。目前DKK3已经被证实在人肾上腺皮质中表达，此外在部分动物脑(主要是啮齿类)和成纤维细胞中亦有表达[2]。与此同时，DKK3被证实在人类多种肿瘤中差异化表达，大部分肿瘤为低表达，包括前列腺癌[3]、肝癌[4]、结肠癌[5]、胃癌[6]、宫颈癌[7]、肺癌[8]、肾细胞癌[9]等。另有研究也表明DKK3具有代谢及免疫相关功能，如免疫调节作用、代谢调节及心脏功能保护等[1]。上皮细胞间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)已在多种恶性肿瘤中被证实参与了肿瘤的侵袭和转移，同时现有的研究也证实了DKK3在部分恶性肿瘤中参与并调控EMT这一过程[10]。然而对于DKK3在前列腺癌细胞系中的功能研究较少，本研究通过上调DKK3在PC3中的表达以探讨其对PC3细胞凋亡、侵袭以及EMT相关蛋白表达水平的影响。
1.1 材料 收集2019年6月～2020年6月于武汉大学人民医院泌尿外科确诊并接受前列腺癌根治手术患者标本24例为研究对象，所有患者在接受手术前均未接受化疗及免疫治疗；
收集同期确诊良性前列腺增生并接受前列腺电切术患者标本24例为对照组。本研究经武汉大学人民医院伦理委员会批准通过。
1.2 主要试剂与仪器 前列腺癌细胞系PC3及人正常前列腺上皮细胞系RWPE-1购自美国模式培养物集存库(ATCC)；
用于细胞培养的DMEM培养基、EMT相关蛋白孵育抗体、10%的胎牛血清、细胞凋亡相关试剂盒和SYBR Green real time PCR试剂分别购自Gibco Life Technologies公司、Abcam公司、碧云天公司以及Takara公司。
1.3 细胞培养与转染 PC3细胞培养在适当条件的培养箱环境(5%CO2，37℃)中进行，并且每隔1～2 d更换新鲜的培养基，1周传代2次。细胞进行常规消化之后，将其接种于6孔板中，当镜下观察到细胞总体密度达到80%的时候，换成无血清培养基进行转染操作。实验组转染ov-DKK3,NC组转染空载质粒(阴性对照)，Ctrl组为对照组。在转染后6 h再将旧培养基换新鲜的完全培养基，细胞转染48 h后再进行相关实验分析。
1.4 免疫组化法检测组织中DKK3表达情况 按免疫组化检测试剂盒说明书对组织标本进行免疫组化染色，随后DAB显色试剂盒显色，苏木精复染，盐酸酒精分色，在光学显微镜下观察DKK3在组织中的表达情况。
1.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 细胞中所有RNA的提取按照Trizol详细步骤进行操作,通过反转录合成cDNA。以cDNA为模板，用SYBR Green做荧光染料，检测E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和DKK3的水平。内参基因为U6 RNA。在92℃下进行反应3 min预变性，接着在94℃下变性30 s，再于55℃退火30 s，72℃延长1 min，循环40次。根据待测标本Ct值，通过2-△△Ct法算出相对表达量。
1.6 细胞凋亡实验 对转染48 h后的各组细胞进行胰酶消化，在胰酶作用后进行离心(3 000 r/min，半径80 nm，12 min)，用无菌PBS液对细胞进行3次充分洗涤，70%预冷乙醇重悬。依照Annexin V-FITC试剂盒操作说明配制溶液，再用250 μL结合缓冲液将其重新悬浮。将10 μL 20 mg/L的碘化丙啶(PI)加至悬液内并于37℃避光条件下孵育1 h，通过流式细胞仪进行检测并进行数据解析。
1.7 细胞增殖实验 收集对数生长期PC3细胞，加入胰蛋白酶消化，制成细胞悬液后调整细胞密度，按照每孔100 μL细胞悬液接种于96孔板，分别于转染24、48、72 h时每孔中加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37℃孵育4 h，弃上清，每孔分别加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，摇床孵育后检测各孔在490 nm波长的吸光度(OD)值。
1.8 Transwell实验 前列腺癌PC3细胞系转染ov-DKK3及空白对照24 h后，消化酶作用下收集细胞，以每孔5×104个接种到Transwell小室。小室上层加入100 μL无血清培养基，下层加入600 μL含血清的培养基继续培养24 h。培养时间到后即刻在荧光倒置显微镜下观察各组细胞侵袭和迁移情况。
1.9 Western blot 各组细胞进行收集后接着将RIPA裂解溶液(PMSF)加至其中，在裂解30 min后采取超声匀浆，再进行细胞总蛋白提取。集其上清后以BCA法测定蛋白浓度。电泳后将凝胶放入电传输槽中进行电转，并转移到硝酸纤维素膜上再密封1.5 h，TBST液充分洗膜后加1∶1 000对抗E-cadherin、Vimentin和N-cadherin蛋白抗体进行稀释并于4℃冰箱孵育过夜。GAPDH为内参对照。加入二抗后室温孵育1 h后进行曝光显影。
2.1 DKK3在前列腺癌组织中表达降低 免疫组化检测显示，DKK3在前列腺增生组织表达明显高于前列腺癌组织(图1)。
图1 DKK3在前列腺癌组织中的表达
2.2 DKK3在PC3细胞中表达水平降低 qRT-PCR法检测显示，与正常前列腺上皮细胞(1.00±0.08)相比，前列腺癌PC3细胞中DKK3表达(0.53±0.06)减少，差异有统计学意义(t=-8.14，P<0.01)。
2.3 过表达DKK3促进PC3细胞凋亡 细胞凋亡实验结果显示，ctrl组、NC组以及ov-DKK3组凋亡率分别为(16.27±1.82)%、(15.80±1.78)%、(28.72±2.56)%。ov-DKK3组凋亡能力较ctrl组及NC组表达增加，差异有统计学意义(F=37.07，P<0.01)，见图2。
图2 过表达DKK3促进PC3细胞凋亡
2.4 过表达DKK3抑制PC3细胞增殖MTT增殖 PC3细胞中ctrl、NC及ov-DKK3组的24、48、72 h细胞增殖率分别为[(53.52±3.64)%、(52.18±3.52)%、(44.53±3.01)%]，[(73.25±4.02)%、(72.15±3.86)%、(60.28±4.18)%]，[(88.56±5.18)%、(84.43±4.92)%、(71.62±4.30)%]。ov-DKK3组增殖能力较ctrl组及NC组表达降低，差异有统计学意义(F=6.10，P<0.05；
F=9.59，P<0.05;F=10.10，P<0.05)。
2.5 过表达DKK3抑制PC3细胞迁移 Transwell细胞迁移实验结果显示，与ctrl组[(86.28±6.23)个]、NC组[(88.16±5.69)个]相比，ov-DKK3组[(48.52±4.37)个]细胞迁移能力减弱，差异有统计学意义(F=49.85，P<0.01)。见图3。
2.6 过表达DKK3抑制PC3细胞侵袭 Transwell细胞侵袭实验结果显示，与ctrl组[(36.28±2.86)个]、NC组[(35.19±2.98)个]相比，ov-DKK3组[(19.88±2.13)个]细胞侵袭能力减弱，差异有统计学意义(F=35.04，P<0.01)。见图4。
图3 过表达DKK3抑制PC3细胞迁移
图4 过表达DKK3抑制PC3细胞侵袭
2.7 过表达DKK3对PC3细胞中EMT相关蛋白表达水平的影响 Western blot实验结果显示,ov-DKK3组中E-cadherin蛋白水平(0.71±0.05)比ctrl组(0.46±0.04)和NC组(0.40±0.04)升高，差异具有统计学意义(F=42.68，P<0.01);与ctrl组(0.42±0.03、0.40±0.03)和NC组(0.32±0.03、0.41±0.03)相比，ov-DKK3组中Vimentin和N-cadherin蛋白(0.18±0.02、0.25±0.02)水平降低，差异有统计学意义(F=59.45，P<0.01;F=32.86，P<0.01)。qRT-PCR实验结果显示,ov-DKK3组中E-cadherin mRNA水平(3.56±0.25)比ctrl组(1.00±0.18)和NC组(0.98±0.16)升高，差异具有统计学意义(F=164.40，P<0.01);与ctrl组(1.00±0.07、1.00±0.07)和NC组(1.03±0.08、1.02±0.07)相比，ov-DKK3组中Vimentin和N-cadherin mRNA(0.56±0.06、0.45±0.05)水平降低，差异有统计学意义(F=41.82，P<0.01;F=76.56，P<0.01)。见图5。
图5 过表达DKK3对PC3细胞EMT相关蛋白表达的影响
前列腺癌是男性最常见肿瘤之一，全球范围内发病率约占成人恶性肿瘤的7.3%[11]。在我国前列腺癌确诊患者大多数分期偏晚，尤其是进展至转移性去势抵抗前列腺癌(mCRPC)后治疗效果不佳，治疗靶点少，预后极差。DKK3是一种分泌性糖蛋白，属DKK蛋白家族成员，多篇文献报道DKK3在多种恶性肿瘤组织中有异常表达[12]。研究表明EMT相关蛋白在前列腺癌侵袭和转移中扮演重要角色，且这一作用与患者预后密切相关，其机制可能与前列腺癌细胞发生EMT转化后获得更强的侵袭和转移能力有关[13]。已有文献证实DKK3在部分肿瘤中与上皮细胞间质转化过程相关[10]，但其在前列腺癌中与EMT的关系以及对细胞凋亡以及肿瘤生物学行为(如迁移和侵袭)的影响仍不明确。
为进一步探究DKK3在前列腺癌中与上皮细胞间质转化的关系以及其对凋亡、迁移和侵袭的影响。本研究结果显示前列腺癌组织和细胞中DKK3表达明显减少，这一结果与DKK3在大部分肿瘤中的低表达相符。在此基础上，本研究通过上调DKK3在PC3中的表达以探讨其对PC3细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭以及EMT相关蛋白的影响。结果显示，过表达DKK3可以促进PC3细胞凋亡，同时抑制PC3细胞的增殖、迁移及侵袭能力。与此同时，过表达DKK3后E-cadherin蛋白表达水平升高，而另外两种EMT相关蛋白Vimentin和N-cadherin的表达水平下降，这也可以从分子水平揭示DKK3能够通过调控EMT相关蛋白表达水平降低前列腺癌侵袭和转移的风险。
综上所述，DKK3可能作为一种抑癌基因在前列腺癌发生与发展的一系列过程中扮演了重要的角色，其通过靶向调控EMT相关蛋白从而影响前列腺癌的侵袭和迁移，并最终抑制前列腺癌的发生发展。
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