郭昊，鲍子谷
（广州中大环境治理工程有限公司，广东 广州 510320）
自然环境下，存在于污水中的氮素主要为氨氮、亚硝态氮、硝态氮、有机氮四种形式，过量氮素会对环境、人类活动造成巨大影响[1]。
水中过量氮处理的方法主要有折点加氯法、膜分离法、吹脱法、离子交换法、催化氧化法等物理化学法以及生物法。生物法以硝化-反硝化的形式在污水处理工艺中得到广泛应用，主要体现在SBR、A/O、A2/O、氧化沟、生物转盘等工艺。常规硝化-反硝化分为三种：完全硝化-反硝化、短程硝化-反硝化（Sharon工艺）[2]、同步硝化-反硝化，其中Sharon工艺能耗、碳源需求量较少，且减少反应时间和污泥产生量；
同步硝化-反硝化具有反应空间小、建设和运行成本低、稳定性好等优点，是近年来研究的热点方向之一[3]。
本研究拟筛选出高效的异养硝化-好氧反硝化细菌，通过探究菌株在不同条件下的脱氮特性总结出菌株的最佳反应条件；
在该条件下探究菌株对不同氮源的利用情况并做氮平衡分析，结合过程中扩增出的功能基因分析菌株的氮代谢路径，为异养硝化-好氧反硝化现象发生机理的研究提供参考。
1.1 仪器和试剂
UV-6100紫外-可见分光光度计；
SW-CJ-2FD洁净工作台；
HNY-2102恒温振荡培养箱；
LRH-250F生化培养箱；
JPSJ-605F溶解氧测定仪；
PH350型pH测定仪；
NMM-820TRF精密显微镜；
AX224ZH/E分析天平；
LDZH-100KBS立式压力蒸汽灭菌器；
BD/BC-256J变温冷冻冷藏箱。
七水合磷酸氢二钠；
磷酸二氢钾；
氯化钠；
柠檬酸钠；
硫酸镁；
氯化钙；
硫酸铵；
硝酸钠；
亚硝酸钠；
细菌学蛋白胨；
酵母浸膏；
草酸铵结晶紫；
碘液；
乙醇；
番红染色液；
格里斯试剂；
锌粉；
甘油。
1.2 实验方法
1.2.1 基础培养基
（1）M9培养基
本试验M9培养基配方如表1所示，各个组分均需要单独分装灭菌，使用时在超净工作台中将各成分按照比例加入无菌锥形瓶中，使用HC（l0.1 mol/L）和NaOH（0.1 mol/L）将pH调整至7.2±0.1。M9矿物盐1 L溶液中含有Na2HPO4·7H2O 64 g，KH2PO415 g，NaCl 2.5 g。在配制时用超纯水溶解，混合摇匀后用超纯水定容至1L。
（2）氨氮培养基
使用NH4SO4作为唯一氮源，配制9.44 g/L的NH4SO4溶液并进行高压蒸汽灭菌，使用此溶液作为基础培养基中唯一的氮源成分，即为氨氮培养基。
（3）富集培养基
本试验使用LB培养基作为富集培养基，使用超纯水溶解各组分并定容至1 L，将pH调整至7.2±0.1，分装至锥形瓶中并在高压蒸汽灭菌锅压力为0.1 MPa，温度为121℃条件下灭菌30 min，冷却后使用。配制固体LB培养基需要另外加入2%（W/V）琼脂，灭菌后倒板制成LB平板并在冷却后使用。
1.2.2 异养硝化细菌的分离与纯化
在超净工作台中称取5 g的活性污泥或河道底泥样品分别加入到100 mL氨氮培养基中，将接种后的培养基在温度为30℃、转速为100 r/min的恒温摇床中培养72 h。培养后的菌液在超净工作台中吸取1 mL接种至100 mL氨氮培养基中，重复以上步骤三次，使样品中的异养硝化细菌占据优势地位从而被富集。
在超净工作台中将1 mL上述菌悬液加入至9 mL无菌生理盐水中即得到该样品稀释10倍后的菌悬液，继续梯度稀释，得到稀释至10-5、10-7、10-9倍的菌悬液，分别吸取0.1 mL加在LB固体培养基上，后使用玻璃涂布棒涂布，用封口膜将培养皿封口后放入生化培养箱中，在30℃下恒温培养24 h。将不同形态的菌落单独挑出在LB固体培养基上划线，并于30℃条件下培养24 h，重复划线三次得纯菌。
1.2.3 异养硝化效果验证
将分离得到的纯菌分别接种至100 mL无菌氨氮培养基中，在30℃、100 r/min的恒温摇床中培养，在8 h、16 h、24 h、36 h、48 h时取菌悬液1 mL，滴加两滴格里斯试剂并静置片刻，若菌悬液呈现红色则表明有亚硝态氮产生；
若滴加格里斯试剂5 min后仍未显色，则在菌悬液中加入少许锌粉，静置片刻，若出现红色则说明菌悬液中存在硝态氮。能够出现显色反应的菌株可以初步认为具有硝化作用。
1.2.4 革兰氏染色与菌种保藏
在洁净无菌载玻片上滴一滴无菌水并挑取适量脱氮菌涂布并风干，将载玻片底部快速通过酒精灯2次加以固定。将已固定的载玻片放平并滴加适量草酸铵结晶紫染液染色1 min，然后用无菌水缓缓冲洗染液并吸去多余水分。平放载玻片，滴加碘液并染色1 min，再次使用无菌水缓缓冲洗染液并吸去多余水分。将载玻片倾斜并滴加95%酒精冲洗，在流下的染液刚刚不出现紫色时立即停止。滴加适量番红染液并染色1 min，使用无菌水冲洗并吸去多余水分。使用显微镜观察并拍照。
将待保藏菌种接种于无菌LB培养基中并放置于合适环境中培养，待其生长至对数生长期后，取适量菌悬液与已灭菌60%甘油按照体积1∶1混合后密封并编号，迅速置于-80℃冰箱中，保存6个月以上。
1.2.5 水质指标检测方法
本试验中NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN等水质指标的测定均采用国家标准方法，具体测定方法参照国家环保总局编订的《水和废水监测分析方法》。NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法，NO2--N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法，NO3--N采用紫外分光光度法，TN采用碱式过硫酸钾紫外分光光度法。
1.2.6 影响因素验证
本试验以M9培养基为基础，以硫酸铵为唯一氮源，并将NH4+-N浓度配置为200 mg/L，以柠檬酸钠作为唯一碳源，分别测定最佳C/N、温度、接种量。
C/N：将C/N分别调整为0、5、10、15、20。细菌接种量为1%，接种后于30℃、100 r/min的恒温摇床中培养并按时取样测定水质指标。
温度：细菌接种量为1%，接种后分别于5℃、15℃、25℃、35℃、40℃的恒温摇床中以100r/min培养并按时取样测定水质指标。
接种量：细菌接种量分别为0.1%、1%、2%、5%、10%，接种后于30℃、100 r/min的恒温摇床中培养并按时取样测定水质指标。
1.2.7 氮平衡计量
取接种后培养至某时刻（t=0表示反应起始时刻）的水样，将水样分为两份，一份使用超声细胞破碎仪破碎后测定总氮含量（TN水样）t，另一份水样使用0.22 μm滤膜过滤并分别测定氨氮含量（NH4+滤液）t、亚硝态氮含量（NO2-滤液）t、硝态氮含量（NO3-滤液）t、总氮含量（TN滤液）t。计算方法如下：
则t时刻全部氮素=TN气态t+TN胞内t+NH4+滤液t+NO2-
滤液t+NO3-
滤液t+DON滤液t
1.2.8 功能基因扩增与分析
（1）选取引物
通过查阅文献寻找氮循环过程中的功能基因通用引物，针对标记基因amoA、napA、nirK、nosZ的优化引物与PCR反应程序，引物所用的Oligo DNA在华大基因公司合成。
（2）总DNA提取与转接
首先是SDS法提取总DNA，其次使用TAKARA的pMDTM18-T Vector Cloning Kit试剂盒进 行DNA片 段的连接。
（3）PCR扩增
反应采用50 μL反应体系：2×Green Mix 2.5 μL，dNTP 2 μL，正反引物各2 μL，菌株L2总DNA 1 μL，ddH2O 18 μL。PCR反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 sec，58℃（温度低于引物Tm值2℃～3℃）褪火30 sec，72℃延伸2 min（1 min/kb），72℃终延伸7 min，16℃保温；
共35个循环，完成后得到PCR扩增产物。
（4）凝胶电泳观察并切胶测序
使用制胶工具制作琼脂糖凝胶，100 mL 1%（W/V）琼脂糖凝胶配方如下：
1 g琼脂糖投入100 mL的TAE或TBE缓冲液中，微波炉加热溶解，待冷却至室温后加入5 μL以下的Gold View混匀，避免出现气泡。混匀的胶倒入放有制胶板的制胶槽中，避免出现气泡；
在制胶槽的卡口处插入合适大小的制胶梳。
凝胶凝固后，将凝胶与制胶板一同取出，将点样孔一侧正对着负极放入电泳槽，确保缓冲液（TAE或TBE）的液面没过凝胶，胶孔内无气泡。将5 μL的PCR产物加入到胶孔中，留下空白点样孔加入DNA Marker，在120 V电压下电泳15 min，结束后关闭电泳仪，将凝胶同制胶板拿出电泳槽，将凝胶置于凝胶成像仪拍摄区域在紫外下拍照保存。使用琼脂糖凝胶回收试剂盒（OMEGA）对特异性较好的基因条带进行回收并委托华大基因进行测序。
（5）功能基因的生物信息学分析
将测序得出的基因序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，并根据结果使用MEGA软件构建系统发育树。
2.1 异养硝化细菌的筛选与鉴定
本试验从广州、珠海市某污水处理厂二沉池活性污泥中筛选出菌株L1、L2、Z1和Z2，广州某河段底泥中筛选出菌株G1，共5株异养硝化细菌。分别将L1、L2、Z1、Z2、G1这5株细菌接种于氨氮培养基中并培养48 h，各细菌的硝化效果如图1（a）所示。5株细菌中L1、L2、Z1三株细菌均表现出较高的NH4+-N去除率，分别为82.6%、87.6%和88.4%，其中Z1菌株在培养过程中，累积的NO2--N量远高于L1、L2菌株；
L1菌株NO3--N累积量为24.3 mg/L，高于L2菌株的13.9 mg/L。陈云增等[4]发现当饮用水中含有过量的硝酸盐时，饮用者患癌症的风险会大大提高，过量的硝酸盐、亚硝酸盐会严重危害人类健康。因此，L2菌株为本次研究对象。
对L2菌株进行对数生长期测定，其结果如图1（b）所示；
对其进行分离纯化，便于后期保藏，其过程如图1（c）所示；
分离提取对数生长期L2菌株的DNA，使用16S rDNA测序，通过BLAST比对，其系统发育树如图1（d）所示，可以看出，菌株L2与门多萨假单胞菌P.mendocinaATCC 25411相似度最高，因此将L2菌株命名为P.mendocinaL2。目前，门多萨假单胞菌的研究多见于生物降解芳香烃[5]、细菌感染[6]、生物柴油[7]、发酵褐藻寡糖[8]等领域，较少见于生物脱氮，研究L2菌株的生物脱氮特性有助于拓展异养硝化-好氧反硝化细菌的研究深度，更深入地挖掘门多萨假单胞菌的特性。
图1 硝化细菌的筛选、分离、鉴定图Fig.1 Screening，isolation and identification of nitrifying bacteria
2.2 异养硝化细菌脱氮的影响因素探究
本实验将分别探究在不同C/N、温度、接种量条件下菌株L2的生长和脱氮情况，并通过分析得到菌株L2的最适反应条件。
2.2.1 C/N
首先，将C/N梯度分别设置为0、5、10、15、20以探究不同C/N对菌株L2生长繁殖和脱氮的影响，结果如图2所示。
图2 菌株L2在不同C/N条件下的生长和脱氮情况Fig.2 Growth and denitrification of strain L2 under different C/N ratio
不同C/N对菌株的生长产生显著的影响：当C/N较低时，细菌生长受到抑制；
而当C/N高于5以后，其生长状况基本不受C/N影响；
当C/N=0时菌株L2在48 h内几乎不生长，这再次证明了菌株L2为一株异养细菌；
当C/N＞5以后菌株L2生长基本不受抑制，其OD600值均明显高于C/N=5时的菌株生物量，表明当C/N＞5以后细菌就可以保持正常生长，此时碳源不再是细菌生长的限制性因素。随着C/N不断升高，氨氮去除率逐渐增加，当C/N=15时，氨氮去除率达到最大值98.2%，继续增加C/N会略微提高氨氮去除速率，但最终氨氮去除率不受影响，而在这过程中亚硝态氮和硝态氮几乎不受影响。
综合去除效果和经济效益，选择最佳C/N=15，这与C.metalliduransS1[9-10]、V.diabolicusSF16[11]的最佳C/N接近，同时也符合异养硝化-好氧反硝化菌株最适C/N通常在5～15的研究结果[12]。相较于传统的自养硝化细菌，异养硝化-好氧反硝化细菌更适合于处理同时存在较高有机物与较高氮素污染的污水，在较高C/N的污水中既能以远超自养微生物的速度快速繁殖，又能够同时去除有机物，十分适合用于养殖废水、食品加工废水等的处理。
2.2.2 温度
微生物的硝化、反硝化反应会受到基因转录调控与翻译、翻译后修饰、酶活调控的影响。温度能够影响含氮化合物在细胞内外的传递速率、基因的表达、微生物体内酶的活性，从而影响硝化和反硝化反应。如图3所示，温度对于菌株L2的生长具有显著影响：当温度较低时，菌株L2的生长存在较长的适应期；
随着温度的增加，菌株L2的生长速率也不断提高；
当温度达到30℃时，细菌生长速度较快，且稳定期生物量较高；
在35℃时细菌生长最快；
随着温度的升高，微生物对于氨氮的降解速率和最终去除率均在不断升高，当温度升高至30℃和35℃时，氨氮降解速率达到最大，在8～24 h内几乎将氨氮全部转化；
但在35℃环境中的菌株L2在48 h时氨氮浓度略有升高，结合其OD600在后期的下降，可以认为在较高温度下部分老化细菌自溶并将体内的含氮化合物释放到环境中，有机氮被矿化为氨氮。
图3 菌株L2在不同温度条件下的生长和脱氮情况Fig.3 Growth and denitrification of strain L2 under different temperature
菌株L2在不同温度下均未出现较高程度的亚硝态氮累积，脱氮过程中酶的活性受环境温度的影响极大：当温度过低时，酶的活性会大大降低，甚至发生可逆失活；
当温度高于酶的最适温度时，酶的结构会遭到破坏甚至失活，此时正常的生理活动难以维持。因而一个合适的温度对于微生物的生长和脱氮尤其重要。目前发现的大部分异养硝化细菌的最适温度保持在30℃～35℃之间[13]。综合考虑菌株L2的生长和脱氮情况，选择30℃为后续研究时的环境温度。
2.2.3 接种量
微生物在培养基内的生长通常会经过适应期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。接种时的细菌生物量是微生物后续繁殖的基础，会极大影响到细菌的后续生长和脱氮过程。结果如图4所示，L2的生长情况受接种量的影响很大，主要体现在菌株L2的生长速率上，但是基本不会影响48 h后的生物量。
图4 菌株L2在不同接种量条件下的生长和脱氮情况Fig.4 Growth and denitrification of strain L2 under different inoculum conditions
接种量会显著影响硝化和反硝化反应速率，但对于氨氮和总氮的去除率几乎没有影响。这是因为硝化和反硝化反应主要发生在对数生长期，接种量提高时微生物能更早地进入对数期，硝化和反硝化反应会更早更快进行[14]。但由于固定环境的生物承载量是确定的，所以不同接种量并不会影响最终的生物量，也不会影响到氨氮和总氮的最终去除率。综上，选择接种量1%作为后续研究条件。
2.3 氮代谢途径的探究
在氮代谢和氮平衡实验中，培养基在C/N为15，培养温度为30℃的条件下以1%的接种量接种菌株L2，48 h内菌株L2的生长和氮元素转化情况如图5（a）所示。前8 h为生长适应期，8 h后细菌进入对数生长期并在24 h时达到稳定期，氨氮和总氮随着菌株的生长不断降解，并在24 h时基本去除完毕，此时氨氮去除率为97.5%，平均去除速率为7.90 mg/L·h，总氮去除率为36.0%，平均去除速率为3.05 mg/L·h。
图5（b）为以氨氮为唯一氮源时的氮素物料平衡分析图，16 h时氨氮被大部分去除，剩余氨氮占总氮素的21.34%，氨氮去除率为77.73%，同时产生较多气态氮，总氮去除率达到29.5%。在进行脱氮的同时产生了6.0%的亚硝态氮累积和7.9%的溶解性有机氮。8～16 h细菌进入对数生长期，菌株L2的生物量快速增加，因此大量的氨氮被微生物吸收用以合成氨基酸、核酸等含氮有机物，所以细胞内源氮占比提高。研究表明，所有氮素只有在转化为谷氨酸的形式后才能被细胞利用[15]，所以此时的培养基中相较8 h存在更多的溶解性有机氮，这些有机氮可能是氨氮在转化为谷氨酸过程中的中间产物。
图5 菌株L2的脱氮（a）及氮平衡（b）情况Fig.5 Nitrogen removal and nitrogen balance of strain L2
综合来看，不难发现菌株L2对氨氮和总氮均具有较好的去除效果，在24 h内去除率分别达到97.5%和36.0%。通过氮平衡可以看出，菌株L2对水体中氨氮去除的途径主要有两个：一是通过细菌的生长繁殖将氨氮吸收并转化为细胞内源氮；
二是通过异养硝化-好氧反硝化作用将氮素转化为中间产物并最终转化为气态氮[16]。
为了更加深入地理解菌株L2的氮代谢过程，本实验使用特定引物分别扩增出菌株L2的氨单加氧酶基因（amoA）、硝酸盐还原酶基因（napA）、亚硝酸盐还原酶基因（nirK）、氧化亚氮还原酶基因（nosZ），并使用生物信息学对基因序列进行分析，回收产物连接T载体pMD18T进行大肠杆菌（DH5α）转化。扩繁后提取重组质粒，使用通用测序引物对M13F/M13R测序后，从L2菌株中扩增出氮转化途径相关基因。通过查阅文献，参考已报道的与L2菌株同种属细菌中的相关酶系的基因序列[17]，设计并选择引物如表1和图6。
表1 各基因扩增引物Tab.1 Amplification primer of gene
图6 氮代谢基因凝胶电泳图Fig.6 Gel electrophoresis of nitrogen metabolism genes
为了确认菌株L2中脱氮关键酶系的存在，本实验以特定引物对菌株L2的DNA进行扩增并鉴定，分别从菌株L2中扩增出amoA、napA、nirK、nosZ四种脱氮相关的功能基因。通过分析菌株L2在不同氮源条件下的氮平衡，结合功能基因扩增的结果，可以判断菌株L2是一株异养硝化-好氧反硝化细菌，能够分解利用氨氮、亚硝态氮、硝态氮进行生长和脱氮，三种氮源的去除主要通过菌株L2的同化作用和异养硝化-好氧反硝化作用，其中一部分氮素被菌株L2同化为细胞内源氮，一部分被菌株通过异养硝化-好氧反硝化作用转化为氮气，菌株在氨氮中的生长和脱氮情况最好，硝态氮次之，亚硝态氮最差。推测菌株L2完整的脱氮路径为通路1：NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2，见图7。
图7 菌株L2推测脱氮路径Fig.7 Strain L2 speculated denitrification pathway
本研究从环境中筛选出一株异养硝化-好氧反硝化细菌P.mendocinaL2，探究了C/N、温度、接种量对其生长和脱氮情况的影响，并在最适条件下探究了菌株L2对于氨氮的分解利用情况，作出48 h氮循环分析，通过分子生物学手段扩增出菌株L2内氮转化过程中的关键基因并进行简单的酶学分析，结合氮循环分析菌株L2的氮转化途径。通过研究得出如下结论：
（1）菌株L2为革兰氏阴性细菌，为门多萨假单胞菌，将其命名为P.mendocinaL2。已报道的异养硝化-好氧反硝化菌株中假单胞菌属（Pseudomonas）、副球菌属（Paracoccus）和芽孢杆菌属（Bacillus）菌占多数，故菌株L2的异养硝化-好氧反硝化潜能较高。
（2）通过探究不同因素对菌株L2的生长和氮转化情况的影响，发现在C/N为15，培养温度为30℃，接种量为1%时菌株L2的生长和脱氮状况达到最佳，表明菌株L2不需要严苛的环境条件即可表现出高效的脱氮能力。
（3）从菌株L2代谢的氮平衡分析来看，含氮污染物的降解主要有两条途径：一大部分通过同化作用转化为细胞内源氮；
另一部分经异养硝化-好氧反硝化作用转化为气态氮，这与目前研究发现的其他异养硝化-好氧反硝化菌株的氮代谢途径一致[12]。
（4）使用各个基因的特定引物对菌株L2进行PCR扩增，回收产物连接T载体pMD18T进行大肠杆菌（DH5α）转化。扩繁后提取重组质粒，使用通用测序引物对M13F/M13R测序后，从L2菌株中扩增出氮转化途径相关基因，结合不同氮源条件下菌株L2的氮转化情况，推测菌株L2的完整硝化及反硝化路径为：NH4+→NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→NO→N2O→N2，这 与A.sp.LAD9[18]以及R.sp.CPZ24[19]所表现出的完全硝化-反硝化路径相同。
由实验可知，菌株L2作为异养硝化细菌，其生长繁殖速度远高于自养硝化细菌，在快速的生长繁殖过程中会同化大量的氮素用以合成蛋白质、核酸等大分子。虽然大部分氨氮被同化为细胞内源氮，但在污水处理中能够通过污泥的形式将这一部分氮素去除，所以异养硝化细菌对于含氮污水的处理仍具有一定的实用价值。
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