吴丽娟，雷小文，刘珍妮，谭东海，谢华亮，钟云平，黎观红，张泳桢，王文海，邓茂林，李建军*
(1. 赣州市畜牧水产研究所，341000，江西，赣州；
2.江西农业大学，330045，南昌；
3. 瑞金市杰仕柏蚯蚓养殖有限公司，342500，江西，赣州)
硒是生命体重要的营养元素，对动植物体免疫、抗氧化及生长发育和繁殖等方面均有积极的作用[1-2]。中国作为公认的缺硒大国，72%的地区属于低硒或缺硒地区，且土壤中有效硒含量只占总硒的1.7%～5.5%，植物难以吸收转化利用[3]。食物是人体补硒的重要途径，而土壤缺硒会通过食物链影响动植物体中硒的含量。经调查发现，中国不同地区居民平均硒摄入量仅为43.3 μg/d，远低于成人推荐硒摄入量60～400 μg/d[4-5]。因此，需要通过提高土壤及膳食中硒的含量来改善人体硒摄入不足的营养问题。
有机硒一般以硒蛋白、硒氨基酸和硒多糖等形式存在，与无机硒相比，具有毒副作用小、活性强及吸收率高等优点，是人体及动植物最佳的营养硒源。蚯蚓体含有丰富的蛋白质、脂质、氨基酸、矿物质和生物活性物质，具有促进畜禽生长、提高免疫功能和维护肠道健康的功能，是一种绿色安全高效的饲料添加剂[6-8]。蚯蚓粪是蚯蚓体的代谢物，富含氮、磷、钾等可溶性盐及植物生长激素、腐殖酸、氨基酸、土壤酶、有机质等物质，且含有数量庞大、种类丰富的微生物群体[9-12]，同时兼具了生物有机肥、氨基酸肥和腐殖酸肥等肥料的特性，是一种高效的有机肥。蚯蚓体对硒具有很好的转化作用，在蚯蚓基料中外源添加无机硒，蚯蚓体能将无机硒高效转化为有机硒[13-14]，且对蚯蚓粪中硒的含量也有积极作用[15]。岳士忠[16-17]指出低浓度的亚硒酸钠(0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg)对蚓体生长繁殖没有影响，且随着外源硒添加浓度的升高，蚓体总硒及有机硒含量也增加，但未分析高浓度对蚓体生长繁殖情况及蚓粪中硒转化效果。刘军[18]研究表明，在牛粪中添加40 mg/kg的亚硒酸钠可显著提高蚓体和蚓粪中总硒及有效硒的含量，但未系统分析不同硒添加浓度对蚓体和蚓粪中硒的转化效果以明确硒的最佳添加浓度。本研究以太平2号蚯蚓为试验材料，牛粪为蚯蚓养殖基料，探讨不同浓度亚硒酸钠对蚯蚓体及蚯蚓粪硒的转化效果，并结合蚓体生长的情况，寻求亚硒酸钠适宜添加浓度，旨在为含硒蚯蚓体作为饲料添加剂和含硒蚯蚓粪作为有机硒肥的开发应用提供研究基础。
1.1 试验材料
蚯蚓(太平2号)由瑞金市杰仕柏蚯蚓养殖有限公司提供，单条体重约为0.12～0.13 g；
牛粪，经陈化1个月，自然风干，过4 mm筛，由瑞金市杰仕柏蚯蚓养殖有限公司提供；
亚硒酸钠购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 试验设计
试验设置6个处理组，分别为Se0(发酵牛粪)，Se20(20 mg/kg硒添加量+发酵牛粪)，Se40(40 mg/kg硒添加量+发酵牛粪)，Se60(60 mg/kg硒添加量+发酵牛粪)，Se80(80 mg/kg硒添加量+发酵牛粪)，Se100(100 mg/kg硒添加量+发酵牛粪)。
1.3 试验方法
蚯蚓养殖：取适量亚硒酸钠溶于去离子水中配制成硒浓度为2 g/L的溶液，分别取0 mL、50 mL、100 mL、150 mL、200 mL、250 mL配好的硒溶液加入到5 kg(干重)牛粪中得到硒浓度分别为0 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg、60 mg/kg、80 mg/kg和100 mg/kg的培养基料，每个浓度做3个重复，各组水分控制在55%～65%左右，陈化1周。参照刘向辉等[19]试验方法，采用模拟蚯蚓室外养殖方法，在温室大棚中隔出长80 cm×宽60 cm×高60 cm的蚯蚓饲养床，床底部铺一层不漏水的塑料膜(防止硒流失)，然后放入陈化好的基料，每床分别接种500 g太平2号蚯蚓，做好标记，同时，每床分别随机挑选100条蚯蚓，称重，并记录；
在大棚中培养58 d(18～20 ℃)，每天喷少量的水以保持基料的湿度(55%～65%)。
蚓体和蚓粪收集：采用惧光法，将蚯蚓和基料平铺在塑料薄膜上，设置好灯光，逐层去除表层基料，反复多次，即可获得蚓体和蚓粪。
1.4 测定指标及方法
1.4.1 蚓体重量的测定 培养58 d后，收集所有蚓体，称取总重，并记录。
1.4.2 单条蚓体增重的测定 培养前和培养58 d后，每床分别随机挑选100条蚯蚓，称重，并记录。单条蚓体增重百分比=(培养后百条重-培养前百条重)/100*100%。
1.4.3 蚓体和蚓粪总硒及无机硒含量的测定 培养58 d后，每床随机挑15条蚯蚓，黑暗环境下清肠12 h，去离子水清洗干净，滤纸擦干，冷冻干燥，备用。每床收集50 g蚓粪，自然风干，备用。分别参照GB5009.93—2017中电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS法)测总硒含量和参照刘军[18]试验方法测无机硒的含量。
蚓体有机硒的含量=蚓体总硒含量-蚓体无机硒含量；
蚓粪有机硒的含量=蚓粪总硒含量-蚓粪无机硒含量。
1.5 数据统计分析
采用Excel和SPSS17.0进行数据统计分析，所有数据均以平均值±标准差(SD)表示，采用One-Way ANOVA 进行方差分析，采用最小显著极差法(LSD)对差异显著的数据进行多重比较，P< 0.05表示差异显著，P< 0.01表示差异极显著。
2.1 硒处理对蚯蚓生长的影响
如图1所示，与培养前的500 g蚯蚓重量相比，Se0、Se20、Se40、Se60、Se80和Se100 6个组的蚯蚓重量均有所增加。培养至58 d时，与未添加亚硒酸钠的Se0相比，Se20和Se40蚯蚓重量分别增加1.07%和8.13%，其中Se40与Se0组相比差异极显著(P<0.01)；
而Se60、Se80和Se100的蚯蚓重量分别降低了14.37%、35.54%和17.76%(P<0.01)。
图1 不同浓度硒处理对蚯蚓重量的影响
如图2所示，与培养前相比，Se0、Se20、Se40、Se60、Se80、Se100 6组蚯蚓单体增重率分别为88.41%、108.14%、105.36%、60.21%、86.75%、83.27%。与对照组Se0相比，Se20和Se40组的蚯蚓单体增重率有上升的趋势，但差异不显著(P>0.05)；
与Se20和Se40组相比，Se60组蚯蚓单体增重率显著降低(P<0.05)；
与Se60组相比，Se80和Se100组蚯蚓单体增重率有上升的趋势，但差异不显著(P>0.05)；
Se80和Se100组之间没有显著差异(P>0.05)。
图2 不同浓度硒处理对蚯蚓单体重量的影响
2.2 硒处理对蚓体中转化效果的影响
如表1所示，蚓体培养58 d后，随着硒添加浓度的升高，蚓体中总硒和有机硒含量均显著增加。与对照组Se0相比，Se20、Se40、Se60、Se80、Se100 5个组蚓体总硒的含量分别极显著提高了2.57倍、7.44倍、11.6倍、14.18倍、15.1倍，而蚓体有机硒含量分别显著提高了4.93倍、8.04倍、14.2倍、18.22倍、18.67倍，其中Se100组蚓体总硒和有机硒含量均最高，分别为148.88 mg/kg和99.78 mg/kg。Se60组相较于Se20、Se40组，蚓体总硒和有机硒含量均极显著提高(P<0.01)。Se80、Se100与Se60组相比，蚓体总硒含量分别显著提高了22.23%(P<0.05)和30.13%(P<0.05)，蚓体有机硒含量分别提高了20.62%(P>0.05)和31.47%(P<0.05)，而Se80和Se100 2组间蚓体总硒与有机硒含量变化均不显著(P>0.05)；
由此可见，随着硒添加浓度的升高，蚯蚓体中总硒及有机硒含量的增加速率变缓。另外，还可以看出，蚓体中有机硒占总硒百分比在51.38%～67.02%之间波动。Se0、Se20、Se40 3个处理组有机硒占总硒百分比没有明显的差异，当硒添加浓度达到60 mg/kg时，蚓体有机硒占总硒百分比相对于对照组Se0有显著的提高(P<0.05)，且随着硒添加浓度的升高，有机硒占百分比略微有所提高，但不显著(P>0.05)。
表1 亚硒酸钠处理对蚓体硒含量的影响/mg·kg-1
2.3 硒处理对蚓粪中硒含量的影响
如表2所示，随着硒添加浓度的升高，蚯蚓粪中的总硒和有机硒的含量均显著增加，但其增加速率逐渐变缓。当硒添加浓度为100 mg/kg时，蚯蚓粪中总硒和有机硒含量达到最高，分别为115.48 mg/kg和95.97 mg/kg，与Se80相比，总硒含量呈极显著增加(P<0.01)，有机硒含量呈显著增加(P<0.05)。另外，从蚯蚓粪中有机硒占总硒百分比可以看出，通过外源添加亚硒酸钠可显著提高蚯蚓粪中有机硒的占比率，其中当硒添加浓度为40mg/kg时，蚯蚓粪中有机硒占总硒百分比最高，为94.26%；
之后，随着硒添加浓度的升高，蚯蚓粪中有机硒占比呈下降趋势。与Se40相比，Se100组中有机硒占比显著下降了6.45%(P<0.05)。
表2 亚硒酸钠处理对蚯蚓粪硒含量的影响/mg·kg-1
3.1 硒处理对蚯蚓生长的影响
硒是动物体生长的必要营养元素，但硒剂量过大会对机体生长产生抑制和毒害作用。大量试验研究表明，过量的硒对蚯蚓的生长具有毒害作用。刘向辉等[19]研究发现，100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg的亚硒酸钠均对蚯蚓具有显著的毒性作用，且亚硒酸钠添加浓度越高，蚯蚓的死亡率也越大。孙晓斐等[16]和刘军[18]研究结果也表明，硒添加浓度分别为100 mg/kg和200 mg/kg时，蚯蚓的生长受到显著的抑制作用。本试验得出类似的结果，即蚯蚓总重量随着硒添加浓度的升高表现为先升后降，但均为正向增长。其原因可能是由于低浓度硒对蚓体的生长具有促进作用，但高浓度硒会破坏蚓体的代谢平衡，对幼蚓的生长、成蚓及其产茧能力均产生了抑制和毒害作用，造成蚯蚓产茧率下降、幼蚓及部分成蚓逃逸或死亡[20-22]；
另外可能是由于饲养环境的不同，使得本试验中所有组均为正向增长。而Se100组总重量相较于Se80组稍有增加，分析原因可能是成蚓对高浓度硒产生一定的耐受作用，但这还需进一步试验研究。同时，蚯蚓单体增重显示了与蚓体总重量大体一致的规律，当硒添加浓度为80 mg/kg及以上，蚯蚓单体增重有上升的趋势。这可能是由于幼蚓及蚓茧对高浓度硒更敏感，而成蚓对高浓度硒耐受性更强，导致存活下来的蚯蚓基本为个体更大、耐性更强的成蚓。
3.2 硒处理对蚓体中转化效果的影响
在本试验中蚯蚓体对硒表现出很好的转化作用，且硒的转化量随着硒添加浓度的升高而增加。同时，蚓体中有机硒的含量也显著增加，当硒添加浓度达到100 mg/kg时达到最高，但增加率相对有所变缓，这可能是由于高浓度硒影响了蚓体的生长代谢功能，而导致蚓体对无机硒利用率逐渐下降。另外，在本试验中蚓体有机硒含量占总硒百分比只有51.38%～67.02%，与前人报道[13,17](91%～93%)的有一定的差距，这可能是受饲养环境条件的影响限制，导致部分亚硒酸钠进入蚓体内未被吸收利用，蚓体对无机硒的转化利用率不高，后期还需结合蚓体转化条件的优化进一步深入研究蚓体的转化机制。
3.3 硒处理对蚓粪中硒含量的影响
现阶段，为改善我国土壤缺硒的情况，部分地区主要通过施用无机硒肥和有机硒肥来提高土壤中硒的含量[23]。与有机硒肥相比，植物对无机硒肥转化利用率更低，长期的使用容易造成土壤中硒含量超标，这既不利于植物的生长，也会对生态环境造成了严重污染[24-26]。在本试验中，通过硒元素与蚯蚓堆肥的联合利用，可有效提高蚯蚓粪中总硒及有机硒的含量，且有机硒含量占总硒百分比最高可达94.26%。这与前人的研究报道不同，即认为硒元素与蚯蚓堆肥的联合利用后，蚓粪中主要以无机硒为主[17-18]。从本试验数据可以看出，未添加外源硒的蚯蚓粪中有机硒含量占总硒百分比也有80.99%，这说明经蚯蚓代谢后的牛粪中可能存在一定比例富硒能力较强的微生物菌群，并在通过外源添加亚硒酸钠进行硒强化后，显著提高了蚓粪中有机硒转化率。同时，蚯蚓体有机硒主要以硒代蛋氨酸(SeMet)、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)的形式存在[27-28]，本试验条件可能会刺激蚯蚓分泌有机硒转化所需要的酶，并促进其高效分解牛粪中的有机质而产生了大量的氨基酸，为无机硒转化为有机硒提供了物质基础，但还需进行深入研究。而硒添加浓度达到100 mg/kg时，有机硒含量的占比有下降的趋势，这可能与高浓度硒抑制蚯蚓及微生物菌群的生长代谢有关。因此，结合蚯蚓粪与硒的功能性作用，有可能将含硒蚓粪开发作为富硒农作物的有机硒肥，并利用蚯蚓堆肥技术缓解土壤硒污染问题。
在大棚饲养条件下，以发酵牛粪为基料，通过添加不同浓度的外源硒饲养蚯蚓58 d后，随着硒添加浓度的升高，蚓体的生长规律表现出先促进后抑制的变化，但均为正向生长。同时，蚓体和蚓粪中总硒和有机硒的含量，随着硒添加浓度的升高而显著增加，增加率表现出先增后减的趋势；
当硒添加浓度为100 mg/kg时，蚓体和蚓粪转化效果最佳，蚓体中总硒含量为148.88 mg/kg，有机硒含量为99.78 mg/kg；
蚯蚓粪中总硒含量为115.48 mg/kg，有机硒含量为95.97 mg/kg。综上所述，在本试验条件下，当硒添加浓度为100 mg/kg时，蚓体和蚓粪中有机硒的转化效果最好。