何树华, 江 虹
(长江师范学院化学化工学院，重庆 408100)
食品中的色素分为天然色素和合成色素，天然色素在加工或储存过程中易褪色，而合成色素则具有色泽鲜艳、稳定性好、价格低廉等优点。在食品加工业中，常添加各种合成色素来刺激食欲，提高消费者的购买欲望。然而，当色素被超量使用时，可能导致人体中毒、致癌或死亡。由此各国对合成色素的使用作了严格规定，我国GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》规定饮料中胭脂红的含量不得超过0.05 g/kg，酒石黄的含量不得超过0.10 g/kg。可见，研究食品中共存胭脂红和酒石黄的含量有着重要意义。目前报道合成色素检测方法主要有高效液相色谱法[1 - 4]、液相色谱-质谱联用法[5,6]、电化学法[7 - 9]、荧光法[10,11]和紫外-可见分光光度法[12 - 16]。高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法存在成本高、操作繁琐、费时等不足；
电化学法需特殊电极材料；
荧光法对所用试剂有特殊要求；
紫外-可见分光光度法所用设备价廉易购、操作简单、快速，但在食品色素的检测中，常因食品成分复杂，有的共存色素间存在严重的吸收光谱重叠现象，以至于很难用紫外-可见分光光度法进行共存色素的定量分析。文献[14 - 16]报道的分光光度法是用求解复杂的联立方程，文献[12,13]是通过复杂的色素分离措施来实现分光光度法测定共存色素的问题，可见这两种分光光度法均很麻烦。本工作首先将被分析物进行光谱定性分析，确定样品中可能的共存色素，再进行定量分析，这不仅可以大大简化工作流程，还可提高该法的选择性。该法用于实际样品分析，结果满意。
1.1 仪器与试剂
U-3010型紫外可见分光光度计，购自日本日立公司；
pHS-3C型酸度计，购自上海虹益仪器仪表有限公司；
KQ-200VDE型超声波清洗机，购自昆山超声仪器有限公司。
胭脂红(Carmine，CAR，纯度≥98%)标准物质，购自上海源叶生物科技有限公司；
酒石黄(Tartrazine，TAR，纯度≥98%)标准物质，购自北京普析科技有限公司；
碱性艳绿(Alkaline Brilliant Green，ALKG，纯度99%)，购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；
氨丁三醇(Tris，纯度≥99.8%)，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
HCl(分析纯)，购自重庆川东化工有限公司。水为自制超纯水。
样品为市售东鹏功能饮料(1#)和红牛功能饮料(2#和3#)。
1.2 溶液制备
CAR、TAR标准溶液贮备液：1.00×10-3mol/L水溶液(CAR、TAR的质量浓度分别为562.5 mg/L和534.4 mg/L)，操作溶液浓度均为1.00×10-4mol/L(用贮备液稀释)，于冰箱4 ℃保存。Tris溶液为0.20 mol/L水溶液，HCl浓度为0.10 mol/L。Tris-HCl溶液：pH 3.0～9.8，通过酸度计测量Tris和HCl混合溶液的pH。ALKG溶液：1.00×10-3mol/L水溶液。
1.3 样品的制备
准确移取30.0 mL 1#～3#功能饮料，称量(精确到±0.000 1 g)，于超声仪45 ℃超声20 min，取出，冷却后用NH3·H2O调至近中性，60 ℃水浴加热，加入1g已调成糊状的聚酰胺粉末，搅拌、抽滤，用60 ℃ pH 4.0的水(柠檬酸调pH)洗3～5次(5 mL/次)，再用6∶4(体积比)的甲醇-甲酸混合物洗涤3～5次(5 mL/次)，最后用水洗至洗脱液为无色。再用7∶2∶1(体积比)的乙醇-氨水-水混合液解吸3～5次(5 mL/次)至色素完全解吸。合并解吸液，用乙酸中和至近中性，水浴70 ℃蒸发至近干，加适量水溶解并稀至5.0 mL，取定容溶液4.0 mL用水稀释至25.0mL，得1#～3#待测液，储于4 ℃冰箱中。
1.4 实验方法
取适量1#～3#待测样液于分光光度计上扫描(以水作参比)，根据吸收曲线的形状及最大吸收波长确定样液中可能存在的色素。于10 mL比色管中，分别准确加入1.00×10-4mol/L CAR和TAR标准溶液0～1.80 mL、1.00×10-3mol/L ALKG溶液2.00 mL及pH 3.80 Tris-HCl溶液1.00 mL，用水定容。10 min后，于分光光度计上扫描吸收光谱(以试剂空白作参比)，在521 nm测定CAR体系的吸光度，在426 nm测定TAR体系的吸光度。
2.1 CAR、TAR及与ALKG反应的吸收光谱特征
图1中曲线1和2分别是胭脂红和酒石黄标准溶液的吸收曲线，胭脂红的最大吸收波长为504 nm，酒石黄的最大吸收波长为428 nm。曲线3～5分别是1.4节中制得的1#、2#和3#样液的吸收曲线，根据吸收光谱定性分析依据，将样液及标准溶液的吸收曲线形状及最大吸收峰相比较，可以判断1#～3#样中只含CAR和TAR，不含其它色素。由此确定色素范围，有针对性的制定CAR与TAR共存时的定量分析方案，大大简化了分析流程。
图1 胭脂红、酒石黄及1#～3#样品的吸收光谱Fig.1 The absorption spectra of carmine,tartrazine,and 1#-3# samples1.CAR(6.04 mg/L);2.TAR(5.34 mg/L);3-5.1#-3# sample liquid;against water.
ALKG为三苯甲烷类碱性染料，可与酸性染料CAR、TAR以静电引力相作用，生成离子缔合物。图2A表明，CAR和TAR与ALKG在pH 3.80条件下均可发生反应。曲线1是CAR与ALKG反应生成的缔合物的吸收曲线，在可见光区除有2个较大的正吸收峰外，还有较小的正吸收和负吸收峰，最大正吸收峰位于521 nm(相对于ALKG蓝移101 nm，ALKG的最大吸收峰位于622 nm)，次大正吸收峰位于660 nm；
曲线2是TAR与ALKG反应生成的缔合物的吸收曲线，在可见光区有2个明显的正吸收峰，最大正吸收峰位于426 nm(紫移196 nm)，次大吸收峰位于628 nm；
两体系的波移现象表明，CAR和TAR是可以与ALKG反应生成新物质二元离子缔合物。
当选择在521 nm处测定CAR时，CAR-ALKG体系有大的吸光度，而TAR-ALKG体系的吸光度近于0，即共存TAR不干扰CAR的测定；
当选择在426 nm处测定TAR，TAR-ALKG体系有大的吸光度，而CAR-ALKG体系的吸光度近于0，即共存CAR不干扰TAR的测定。从图2可知，在其它吸收峰处测定CAR和TAR，两缔合物的吸收曲线重叠较大，相互间干扰大，不能分别测定共存的CAR和TAR。故选择521 nm作为CAR的测定波长，426 nm作为TAR的测定波长，可实现共存色素CAR与TAR的分别测定。
由图2B可知，在521 nm和426 nm处分别测定CAR与TAR，缔合物均有好的线性关系和较高灵敏度，能用于定量分析共存色素CAR和TAR。吸收光谱特征见表1。
图2 胭脂红、酒石黄与碱性艳绿反应的吸收光谱Fig.2 The absorption spectra of the reaction of carmine,tartrazine with alkaline brilliant greenA：1.CAR(6.04 mg/L)-ALKG(2.00×10-4 mol/L),pH 3.80,against reagent blank;2.TAR(5.34 mg/L)-ALKG(2.00×10-4 mol/L),pH 3.80,against reagent blank;3.ALKG(2.00×10-5 mol/L),pH 3.80,against water;B：1-5.TAR(1.07,3.21,5.34,7.48,9.62 mg/L),ALKG(2.00×10-4 mol/L);6-10.CAR(1.21,3.63,6.04,8.45,10.9 mg/L),ALKG(2.00×10-4 mol/L);pH 3.80,against reagent blank.
表1 胭脂红、酒石黄的吸收光谱特征
2.2 溶液酸度
室温下，考察了1.00 mL不同pH 的Tris-HCl(pH 3.0～9.8)溶液对1.00 mL CAR或TAR(1.00×10-4mol/L)与2.00 mL ALKG(1.00×10-3mol/L)反应生成的离子缔合物的吸光度的影响。结果表明，在pH 3.80的条件下，当测定波长为521 nm时，可单独测定CAR，TAR不干扰；
当测定波长为426 nm时，可单独测定TAR，CAR不干扰(图2A曲线1和2)，故选择1.00 mL pH 3.80 Tris-HCl溶液作为两体系的反应介质。
2.3 反应时间
室温下，考察了选定酸度下5 min～120 min内不同反应时间对两体系吸光度的影响。结果表明，CAR-ALKG体系与TAR-ALKG体系的反应在10 min内均可进行完全；
在10 min～60 min内，两体系的吸光度达最大且基本稳定；
60 min后，随着时间的增加，两体系吸光度均有降低趋势。故测定时间选在10 min后的稳定区。
2.4 方法学考察
2.4.1 标准曲线及灵敏度移取1.00×10-4mol/L CAR、TAR标准溶液0.0、0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mL，分别置于比色管中，加入2.00 mL ALKG(1.00×10-3mol/L)溶液和1.00 mL pH 3.80 Tris-HCl 溶液，用水定容至10 mL。参照1.4 项下的测定方法测定两体系标准系列溶液的吸光度，作标准曲线。结果显示，CAR与TAR两种体系的表观摩尔吸光系数分别为1.26×104L/(mol·cm)、2.63×104L/(mol·cm)。CAR与TAR体系方法有很好的线性关系、较宽的线性范围及较高灵敏度(表2)。
表2 胭脂红及酒石黄的标准曲线相关参数
2.4.2 方法的选择性室温下，考察了某些常见阴阳离子、氨基酸、糖类及某些常见色素对测定6.04 mg/L CAR和5.34 mg/L TAR的影响，见表3。结果表明，当相对误差≤±5%时，常见阴、阳离子及氨基酸、糖类的允许倍数均较大，而常见共存色素中，除日落黄、亮蓝有较大允许倍数外，苋菜红、诱惑红及赤藓红允许倍数相对较小，但被测溶液的定性结果表明样液中不含此3种红色色素。
表3 共存物质的影响
2.4.3 样品测定、准确度及精密度取1#～3#待测样液各2.00 mL，加入2.00 mL ALKG溶液及1.00 mL pH 3.80 Tris-HCl溶液，用水定容至10 mL，在选定测定波长及反应时间下测定各溶液的吸光度(n=5)，并与GB 5009.35-2016法(HPLC法)结果比较，同时作加标回收试验(n=5)。结果见表4，可见，新方法测定结果与国标法相近，并有较高的准确度和精密度，可用于共存CAR和TAR的定量分析。
表4 样品分析结果及回收试验(n=5)
在定性分析基础上，针对样品中存在的色素进行定量分析，不仅可以大大减小分析工作量，而且还可提高光度分析方法的选择性。以ALKG作探针的酸度控制吸收光谱法，不仅简便、快速，有较高灵敏度、较好选择性及较宽线性范围，而且成本低、仪器价廉易于普及；
新方法检测结果与国标法基本一致，准确度和精密度符合定量分析要求。