董明骏 李增攀 周挺
脓毒症是指病原微生物经过各种途径进入体内而引发的全身炎症反应综合征，随着病情的进展，脓毒症可发展为严重脓毒症，甚至感染性休克、多器官功能障碍综合征，最后导致多器官功能衰竭，是急诊和重症监护病房患者的主要死亡原因之一[1]。全球每年新增上百万例脓毒症患者，其中约1/4的脓毒症患者死亡[2]。虽然新型抗菌药物研究、免疫治疗技术、器官功能支持治疗技术不断增强，但脓毒症并没有得到有效控制[3]。目前关于脓毒症的发病机制尚未完全清楚，临床治疗也缺乏特异、有效的治疗手段，主要依靠各种辅助治疗策略。因此深入研究脓毒症发病机制，寻找新的治疗靶点及早期诊断生物标志物具有重要的临床意义。近年来，随着高通量测序技术的发展和普及，生物信息学技术受到普遍关注，目前广泛运用于各种疾病的分子机制研究。本研究利用基因综合表达（gene expression omnibus，GEO）数据库的脓毒症患者芯片，筛选出脓毒症的差异基因并进行生物信息学分析，从而发现与脓毒症相关的关键基因和信号通路，以期为更好地诊断与治疗脓毒症提供新思路。
1.1 资料来源 以“Sepsis”作为搜索词，进入美国国立生物中心的GEO数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中搜索已公布的基因芯片数据集，获取数据集GSE28750、GSE57065、GSE95233芯片。本研究从GSE28750芯片选取10例脓毒症患者外周血样本为脓毒症组，20名健康志愿者外周血样本为对照组；
从GSE57065芯片选取28例脓毒症患者确诊后30 min外周血样本为脓毒症组，25名健康志愿者外周血样本为对照组；
从GSE95233芯片选取51例脓毒症患者入院时外周血样本为脓毒症组，25名健康志愿者外周血样本为对照组。
1.2 差异基因的筛选 使用在线分析工具GEO2R（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r）分别对3个基因集的脓毒症组与对照组之间差异基因进行分析，以校正P＜0.01、｜logFC｜≥1.5作为筛选差异基因的阈值，其中logFC≥1.5作为表达上调基因，log FC≤-1.5作为表达下调基因。利用在线工具（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）对数据集表达上、下调基因取交集，并绘制韦恩图。
1.3 差异基因的功能和通路富集分析 使用DAVID在线网站（https://david.ncifcrf.gov/home/jsp）对筛选到的差异基因进行基因本体论（gene ontolo gy，GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。GO分析包括生物学过程、细胞组分和分子功能。
1.4 蛋白质互作网络（protein-protein interaction networks，PPI）的构建和关键基因的筛选 利用数据库STRING数据库（https://string-db.org/）对筛选出的差异基因进行PPI构建。使用MCODE和cytohubba插件共同筛选出PPI的关键基因，并筛选出最显著模块进行差异基因的功能和通路富集分析。
2.1 差异基因的筛选 从GSE28750芯片筛选出差异基因512个，包括213个表达上调基因和299个表达下调基因；
从GSE57065芯片筛选出差异基因520个，包括256个表达上调基因和264个表达下调基因；
从GSE95233芯片筛选出差异基因612个，包括231个表达上调基因和381个表达下调基因。对3个芯片筛选出的差异基因取交集得到差异基因275个，包括112个表达上调基因和163个表达下调基因，见图1。
图1 GSE57065、GSE95233和GSE28750芯片表达上、下调基因的韦恩图（a：表达上调基因；
b：表达下调基因）
2.2 差异基因的GO和KEGG分析GO分析显示，差异基因主要参与免疫反应、T细胞受体信号通路、固有免疫应答、炎症反应等生物学过程，细胞组分主要集中在质膜细胞表面、胞外外体、质膜外侧等，分子功能主要集中在MHCⅡ类蛋白复合物结合、磷脂转运ATP酶活性、MHCⅡ类受体活性、CD4受体结合等。KEGG分析显示，差异基因主要富集于T细胞受体信号通路、造血细胞系、病毒性心肌炎、炎症性肠病、Ⅰ型人类嗜T细胞病毒感染等通路。
2.3 PPI网络的构建和关键基因的筛选Cytoscape软件可视化分析所得PPI网络包括265个节点和910条边，见图2a（插页）；
利用MCODE插件筛选出最显著的模块，共包含25个基因，见图2b（插页）。对最显著模块中的基因进行GO分析显示，差异基因主要参与T细胞受体信号通路、T细胞活化、T细胞共刺激、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、细胞表面受体信号通路等生物学过程，细胞组分主要集中在T细胞受体复合物、质膜外侧、质膜、免疫突触、α-βT细胞受体复合物等，分子功能主要集中在T细胞受体结合、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶活性、蛋白激酶结合、跨膜信号受体活性等。对最显著模块中的基因进行KEGG分析显示，差异基因主要富集于T细胞受体信号通路、原发性免疫缺陷、造血细胞系、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞黏附分子等通路。利用cytoHubba插件筛选出PPI连接度前10的关键基因，分别为白细胞分化抗原（cluster of differentiation，CD）4、CD8A、C-C趋化因子配体5（chemokine C-C motif ligand 5，CCL5）、淋巴细胞特异蛋白酪氨酸激酶（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase，LCK）、CD28、CD2、白介素7受体（interleukin 7 receptor，IL-7R）、CD3E、白介素2受体β亚基（interleukin 2 receptor beta，IL-2Rβ）、穿孔素（perforin，PRF）1，均包含在最显著的模块中，见图2c（插页）。
图2 PPI的构建和关键基因的筛选（a：PPI；
b：PPI核心模块；
c：连接度前10的关键基因）
尽管近年来关于脓毒症的研究越来越多，但脓毒症死亡率仍居高不下，这可能是由于缺乏早期诊断脓毒症的有效生物标志物。随着基因芯片技术的迅速发展，人类开始从基因层面探索疾病的分子机制。本研究利用GEO2R分析GSE57065、GSE95233和GSE28750芯片中脓毒症患者的共同差异基因，共得到231个表达上调基因和381个表达下调基因。通过GO分析进一步了解差异基因的潜在生物学功能，结果发现这些差异基因主要参与T细胞受体信号通路、免疫相关、细胞质膜组成等生物学过程；
KEGG分析显示，差异基因主要集中在T细胞受体信号通路、造血细胞系、病毒性心肌炎、炎症性肠病、Ⅰ型人类嗜T细胞病毒感染等相关通路。目前认为脓毒症是由于过度全身性炎症反应导致机体免疫功能紊乱所致，而且中性粒细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等免疫细胞参与炎症反应调控[4]。研究表明，微生物感染可以刺激造血干细胞分化成髓样细胞介导免疫反应[2，5]。这些差异基因主要参与炎症反应及免疫应答相关机制，与脓毒症分子机制一致。进一步用STRING数据库对差异基因进行PPI构建，利用MCODE筛选出最显著的模块，共包含25个基因。对这些基因进行KEGG分析，结果显示主要参与T细胞相关信号通路、跨膜受体信号通路、细胞膜组成、原发性免疫缺陷、造血细胞系、自然杀伤细胞介导的细胞毒性、细胞黏附分子等通路；
与差异基因KEGG分析结果大体一致，更说明T细胞信号转导、造血细胞系在脓毒症的发病机制中的重要作用。利用CytoHubba分析筛选出10个关键基因，包含CD4、CD8A、CD28、CD2、CD3E、以 及CCL5、LCK、IL-7R、IL-2Rβ、PRF1，且均来自核心模块。
免疫反应失衡是脓毒症主要机制之一，脓毒症的免疫功能紊乱与T淋巴细胞密切相关[6]。CD4、CD8A、CD28、CD2、CD3E作为T细胞表面活性分子，在免疫应答过程中起着重要作用；
其中CD4、CD8 T淋巴细胞在脓毒症中的作用已被广泛认知。Harland等[7]发现CD8A的CpG甲基化在CD8的下调中具有潜在作用。然而，这种表观遗传修饰是否参与脓毒症的过程尚不清楚，有待进一步研究。CD2可与淋巴细胞功能相关抗原CD58和CD48/BCM1相互作用，介导T细胞与其他细胞类型之间的黏附，参与T细胞信号转导，在炎症反应中也起着重要作用[8-9]。CD28是T淋巴细胞表面表达的共刺激分子，在抗原递呈细胞上与B7结合，介导T细胞的共刺激并促进其存活、增殖以及向靶细胞转移，目前在脓毒症中已有广泛研究。研究表明，脓毒症患者T细胞上的CD28表达下调[10-11]。一项研究表明，CD28对脓毒症期间的肠道免疫反应具有保护作用[12]。另有研究表明，阻止CD28信号传导可减弱炎症细胞因子反应和细菌负荷，提高坏死性软组织感染小鼠模型的存活率[13]。CD3E作为CD3蛋白一个亚链，在T细胞发育中起着重要作用，参与T细胞内部的信号转导，CD3E基因缺陷会导致严重的免疫缺陷[14]，但目前在脓毒症中的研究尚未见报道。CCL5主要由血小板、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和子宫内膜细胞产生，通过与相应的受体结合发挥作用，它在病原体清除、抗原呈递、白细胞活化和存活、慢性炎症、组织修复、纤维化、胚胎发生和肿瘤发生中发挥着关键作用[15-16]。Hwaiz等[17]发现，Rac1通过调节血小板CCL5的分泌并刺激肺泡中CXCL2产生，从而诱导脓毒血症肺损伤中性粒细胞的聚集；
而抑制CCL5可保护脓毒症动物免受肺水肿和组织损伤，因此认为CCL5与脓毒症肺损伤密切相关，但目前尚无临床研究证实。LCK是一种非受体酪氨酸蛋白酶，在促进T细胞的成熟、分化及其成熟后的功能方面具有重要作用。当T细胞受到刺激，T细胞受体激活酪氨酸激酶ZAP70，并且ZAP70再被LCK磷酸化及激活，最终导致淋巴因子的产生[18]。研究表明，LCK的磷酸化通过TLR4信号通路来抑制炎症风暴，LCK可能在炎症反应中发挥重要作用[19]，但是目前关于LCK在脓毒症中作用的相关文章较少，而脓毒症中细胞凋亡诱导的淋巴细胞耗竭是一个值得研究的治疗靶点。IL-7作为趋化因子家族中的重要成员，通过与受体IL-7R结合来促进淋巴细胞生长、巨噬细胞活化以及细胞因子和炎症因子分泌，从而介导免疫应答过程[20]。相关研究报道IL-7R与自身免疫性疾病、慢性炎症及肿瘤有关[21-24]，且在脓毒症治疗和研究中发挥重要作用。动物实验表明，IL-7/IL-7R信号通路激活可以提高脓毒症小鼠存活率[25]。亦有临床研究认为IL-7/IL-7R信号通路与脓毒症患者淋巴细胞功能的改善有关[26]。IL-2Rβ是IL-2R的一个亚单位，通过IL-2结合触发IL-2R，导致大量免疫细胞的增殖和分化，包括T细胞、B细胞和巨噬细胞，因此与体液免疫关系密切。目前有研究表明IL-2Rβ与肺癌[27]、特异性皮炎[28]、脂肪肝[29]等疾病密切相关。此外，IL-2Rβ被认为可作为序贯器官衰竭的评价指标，且与脓毒症死亡率呈负相关[30]。PRF1为穿孔素蛋白，由自然杀伤细胞、细胞毒性T淋巴细胞及T细胞分泌，在免疫调节和免疫监测方面具有重要作用，在肿瘤和免疫性疾病中研究广泛[31]，但在脓毒症中鲜有报道。有研究发现脓毒症患者T细胞和自然杀伤细胞中PRF1基因表达降低，但其具体作用机制仍需要进一步明确[32]。
综上所述，CD4、CD8A、CCL5、LCK、CD28、CD2、IL-7R、CD3E、IL-2Rβ、PRF1是脓毒症关键基因，可能与脓毒症发生、发展相关。后续将对筛选出的关键基因进行基础实验的验证，最终为脓毒症患者的早期诊断和治疗提供有临床意义的分子靶标。
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