侯 骉，黄伟民，王晓明，韩志伟，员建平，邹 龙，王 亮
缺血性心脏病的发病率和死亡率一直居高不下，严重威胁着人类的生命安全［1］。在临床上，缺血性心脏病的治疗策略，无论是支架介入还是冠状动脉旁路移植，目的都是冠状动脉再通恢复心肌供血［2］。因此，很难回避心肌缺血再灌注带来的负面影响，如心肌细胞凋亡、氧化应激和炎症等［3］。为了减轻缺血再灌注所致的心肌损伤，本文在细胞和分子水平，分别观察了微小核糖核酸（miRNA）过表达对缺氧／复氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）所致的细胞凋亡的影响。根据文献报道，miRNA不仅参与了细胞分化、增殖和凋亡的调节，还与心血管疾病的发展密切相关，如心肌梗死、心肌肥大和心肌细胞凋亡等［4］。本研究利用miRNA家族之一的miR－342－5p，对H9c2细胞进行转染，使之过表达miR－342－5p，并建立H9c2细胞缺氧／复氧损伤模型，探究miR－342－5p能否减轻H／R所致的细胞凋亡，为心血管疾病的治疗提供新思路和新靶点。
1.1 材料 H9c2细胞（富衡生物科技有限公司，上海）；
胎牛血清（FBS）、高糖细胞培养基（DMEM）、胰酶（gibco公司，美国）；
逆转录试剂盒、实时荧光聚合酶链式反应（RT－qPCR）试剂盒、miRNA－342－5p模拟物（mimics）、阴性转染质粒（miR－NC mimics）（吉玛基因有限公司，苏州）；
lipofectamine3000转染试剂（Sigma公司，美国）；
CCK－8细胞增殖毒性检测试剂盒、1%青霉素／链霉素、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗（索莱宝科技有限公司，北京）；
B淋巴细胞瘤－2基因相关X（Bax）蛋白、B淋巴细胞瘤－2基因（Bcl－2）、半胱氨酸蛋白酶－3（caspase－3）和3－磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde－3－phosphate dehy⁃drogenase，GAPDH）抗体（abcam公司，英国）。
1.2 研究对象 将H9c2细胞复苏后接种于高糖DMEM完全培养基（含有10%胎牛血清、1%青霉素／链霉素）中，培养于恒温恒湿孵箱中。适时更换新鲜培养基及传代。
1.3 实验分组和miRNA－342－5p转染 根据不同的处理方法将细胞分为四组：空白对照（Sham）组；
H／R处理（H／R组）；
转染miR－342－5p mimics后H／R处理（miR－342－5p）组；
转染mimics control后H／R（miR－NC）组，该组为miR－342－5p的阴性对照组。待细胞融合度为70%～80%时用胰酶进行消化处理，随后接种于6孔培养板（2×105个细胞／孔）。严格按照lipofectamine3000操作说明书，分别将miRNA－342－5p mimics或miR－NC mimics转染至H9c2细胞中，待转染成功后，各组细胞同时给予H／R处理（Sham组除外），缺氧培养（1%O2＋5%CO2＋94%N2）24 h后，更换新鲜完全培养基，再放入常规孵箱（95%空气＋5%CO2）复氧2 h。
1.4 miRNA－342－5p表达水平检测 通过RTqPCR法检测H9c2细胞中miRNA－342－5p的表达水平，用Trizol试剂从细胞中分离总RNA，使用分光光度计（NanoDrop2000）检测总RNA的浓度及纯度。严格按逆转录试剂盒说明书操作，将miRNA合成为cDNA，并以cDNA作为模板，用实时定量聚合酶链反应 仪 进 行 扩 增 反 应。以U6（上 游5’－3GTGCTCGCTTCGGCACATATAC和下游5－3AAAAATATGGAACGCTCACGAATTTG）为 内 参，用2－△△ct法计算miR－342－5p（上游5’－3CGGAG GGGT⁃GCTATCTG和下游5－3CAGATAG CACCCCTCCG）的相对表达水平。
1.5 细胞增殖试验 通过细胞计数试剂（CCK－8）评估H9c2细胞活力。转染成功后，取各组对数期生长的H9c2将各组细胞接种于96孔板（2×103个细胞／孔）中，在正常环境中继续培养24 h和72 h，在不同时间点内加入10 μl CCK－8溶液，在37℃的正常培养箱中再培养2 h。通过酶标仪（Bio－Rad，Cal，USA）测定波长450 nm的光密度（optical density，OD）值，以此对细胞进行增殖测定和生长曲线绘图。
1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集各组生长至对数期的H9c2细胞，制成105／ml的细胞悬液，经磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2次后，离心取下层沉淀，再用结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl膜联蛋白V－异硫氰酸荧光素和10 μl碘化丙啶，避光轻轻振荡混匀，室温放置15 min。15 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况并计算凋亡率。
1.7 蛋白印迹法检测凋亡相关蛋白 将各组细胞收集并用细胞裂解液提取蛋白后，吹匀取20 μl用蛋白浓度测定试剂盒测定样品内蛋白含量，测定后向每组样品加入PBS配平，按4∶1的比例加入5×加样缓冲液后，100℃水浴5 min。取不同组别样品20 μg，采用4%～15%浓度的变性蛋白预制胶（Bio－Rad垂直板式电泳仪）90 min进行分离，然后采用半干转方式转膜70 min。5%BSA封闭液37℃封闭2 h，加入一抗，Caepase－3和Bcl－2为1∶1 000，Bax为1∶2 000，4℃孵育过夜，Western洗涤缓冲液（TBS－T）洗涤3次，每次15 min，偶联辣根过氧化物酶羊抗兔IgG（1∶5 000）室温孵育2 h，TBS－T洗涤3次，每次15 min，显影。内参选用GAPDH。通过BioRad成像系统检测蛋白质条带，随后使用Image J软件定量分析。
1.8 统计学分析 采用Graphpad Prism 8.0统计软件，所有数据以均数±标准差（±s）呈现，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用方差分析（SNK－q检验），P＜0.05为有统计学意义。
2.1 经转染后H9c2细胞miR－342－5p的表达水平 激光共聚焦结果显示H9c2细胞经miR－342－5p和miR－NC转染后，miR－342－5p组的荧光强度与miR－NC组无明显差异，见图1A。结果显示，H9c2细胞经miRNA－342－5p转染后，miR－342－5p组的相对表达量（3.67±0.69）最高，显著高于miR－NC组（1.02±0.11）和Sham组（1.02±0.13），差异有统计学意义（P＜0.05），说明miR－342－5p转染成功。见图1B。
图1 H9c2细胞miR－342－5p的转染和表达水平
2.2 细胞增殖实验结果 通过CCK－8实验发现，在24～72 h的时间范围内，随着时间的推移，三组H9c2细胞逐渐增殖，并且增殖趋势一致。但在24 h、48 h、72 h三个时间点，Sham组的细胞增殖率略高于其他两组，且差异有统计学意义（P＝0.0316）。在被转染的两组，三个时间点的细胞增殖率保持一致，未出现组间差异。见图2。
图2 各组H9c2细胞相对增殖率
2.3 miR－342－5p减轻H／R诱发的细胞凋亡 流式细胞仪检测结果右上象限为凋亡细胞所占比率，见图3A。经H／R处理后，与sham组相比H／R组的凋亡率［（12.4±1.02）%］显著升高，但经miRNA－342－5p转染后的细胞，即miR－342－5p组，凋亡率［（7±1.03）%］又显著下降，说明miR－342－5p可以部分消除H／R诱发的细胞凋亡，量化后的4组结果详见图3B。
图3 miR－342－5p对缺氧／复氧诱导细胞凋亡的影响
2.4 miR－342－5p对H／R诱发凋亡蛋白的影响 利用Western blot免疫印迹方法，检测了三种凋亡蛋白：Bcl－2、Bax和Caspase－3。结果miR－342－5p组中的Bcl－2的蛋白表达水平显著高于miR－NC组与H／R组，而Bax与Caspase－3的蛋白表达水平显著低于miR－NC和H／R组，miR－342－5p部分抑制H／R诱发的细胞凋亡。见图4。
图4 缺氧／复氧后H9c2细胞相关凋亡蛋白的变化
目前全球心脏病患者的首位死亡原因为缺血性心脏病，给社会经济造成了重大负担，虽然医疗技术飞速发展，但其治疗方法目前仍以血运重建为主［5］。缺血意味着心肌细胞缺氧，心肌再灌注就类似于心肌细胞缺氧后复氧，导致心肌细胞受损凋亡，近年来，寻找能有效抑制心肌细胞再灌注损伤后的细胞凋亡一直是国内外基础与临床研究的热点。
以往多项研究表明，细胞凋亡是受到多种凋亡相关基因调控的，其中包括Bcl－2、Bax和Caspase－3等［6］。而miRNA作为真核生物中广泛存在的一种RNA，在细胞生长发育过程中扮演着不可替代的角色，如调节细胞的凋亡、分化、自我更新等［7］。miR－342－5p作为众多miRNA家族中的一员，具有抗凋亡和抗氧化等多种生物学特性。Sun等研究发现，miR－342－5p可通过调节细胞外因子通路，抑制氧化应激水平从而调节动脉斑块的稳定性，以发挥保护血管的作用［8］。Bi等发现，其可靶向磷脂酰肌醇3－激酶Ⅰ型受体来激活蛋白激酶通路，起到促进血管内皮平滑肌细胞的增殖和分化，来保护血管内皮的完整性和光滑性［9］。也有报道指出，长期的运动会增加体内miR－342－5p表达水平的增高，继而减少心肌缺血再灌注损伤［10］。H9c2细胞被广泛用于心肌缺血再灌注损伤的相关研究［11］，因此本研究拟采用H9c2细胞探究miR－342－5p的保护作用和相关机制。
细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的主要因素［5］。Bcl－2和Bax作为凋亡家族中的主要调节因子，但在细胞凋亡途径中却有相反作用，Bcl－2抗细胞凋亡而Bax促细胞凋亡［12］。为了验证miR－342－5p是否影响H9c2的增值效率及抗凋亡作用，笔者通过CCK－8实验和流式细胞术发现，miR－342－5p并不会影响细胞增殖效率，同时也能够有效减少因H／R诱导的凋亡。在细胞相关凋亡蛋白表达方面，笔者通过Western blot实验发现，miR－342－5p可以显著增强H9c2细胞经H／R诱导后Bcl－2的表达量，降低Bax的表达，同时也能有效抑制Caspase－3的表达。
总之，本研究分别从细胞水平和分子水平证实了miRNA家族之一的miR－342－5p，能够有效改善H／R带来的细胞损伤，其保护机制是通过调控Bcl－2／Bax的表达，抑制H／R引起的细胞凋亡。希望这一研究发现能为临床上治疗缺血性心脏病提供新靶点和新思路。
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