牟复美，高如宏，廉凤霞，马文礼，张小兰
（1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；
2.宁夏回族自治区中医医院暨中医研究院，宁夏 银川 750021；
3.宁夏医科大学，宁夏 银川 750021）
白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤疾病，主要是黑素细胞减少或黑素细胞功能障碍，特征表现为皮肤及黏膜色素脱失。目前，全球患病率为0.50%～2.00%［1］，且发病率呈逐年上升趋势，其发病机制尚不明确，比较公认的发病机制与免疫功能紊乱、氧化应激损伤、黑色素细胞功能异常、线粒体结构和功能损伤等因素相关［2］。白癜风虽然不影响患者的身体健康和生命安全，但随着生活水平的不断提高，人们对自己的样貌有了更高要求。白癜风严重影响了患者的精神健康和生活质量，长期外表的明显改变会使得患者产生严重的自卑心理［3］。进而会影响患者的生活质量［4］。乌杞益白胶囊具有滋补肝肾，疏肝调气的功能，使得肝肾精血足而气血和从而使脉络充盈，肌肤得养、白斑得消。笔者观察了乌杞益白胶囊对实验性白癜风豚鼠模型的治疗作用及其作用机制，为其临床应用提供依据。
1.1 材料
1.1.1 试验药物 乌杞益白胶囊（宁夏中医医院暨中医研究院制剂室提供）；
丹芪和血片（合肥华润神鹿药业有限公司，批号：B20020925）。灌胃前用研磨器皿将药物研磨为细末，用纯净水配制。
1.1.2 实验动物 黑色或黑色花豚鼠60只，体重300～400g，雌雄兼用，由宁夏医科大学动物实验中心提供。鼠全价颗粒饲料喂养，饲养于宁夏医科大学动物实验中心。实验动物生产许可证编号：SCXK（陕）2017-001。
1.1.3 仪器 Finnpipette移液器（赛默飞世尔科技中国有限公司），20～200µL；
电热恒温培养箱（武汉一恒苏净科学仪器有限公司）；
Tianshi洗板机、988洗板机（北京天石天力医疗器械技术开发中心）；
Rayto酶标仪，RT-6100，450nm波长（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；
微量高速离心机（型号：TG16W，长沙湘智离心机仪器有限公司）；
冷冻离心机（型号：TGL16M，上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；
恒温摇床（型号：HT-111B，上海赫田科学仪器有限公司）；
电子天平（型号：AE1204，上海良平科学仪器有限公司）、瑞士PRECISA电子分析天平（型号：XB220A）。
1.1.4 试剂 豚鼠酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）ELISA检测试剂盒（江莱生物JL52162）、豚鼠α黑色素细胞刺激素（α-Melanocyte stimulating hormone，α-MSH）ELISA检测试剂盒（江莱生物JL52163）、豚鼠单胺氧化酶（Monoamine oxidase，MAO）ELISA检测试剂盒（江莱生物JL17251）。
1.2 方法
1.2.1 分组、建模、给药 取体重300～400g黑色和黑花色豚鼠60只，雌雄各半。随机分为空白组，模型组，丹芪和血片组，乌杞益白胶囊高、中、低剂量组，每组10只。选择豚鼠背部黑色皮肤为造模部位，先用剪刀剪去造模部位的长毛，再用电动剃毛刀剃去短毛，留出面积约5cm×5cm造模区域，用脱毛膏脱去剃毛区残余黑色短毛。在去毛区涂抹2.5%的氢醌溶液，剂量0.1g/kg，涂抹次数为早晚各一次，连续涂抹30d，建立白癜风豚鼠模型。空白组每天以同样的次数涂抹等量的蒸馏水。除空白组外所有豚鼠经皮肤镜检查证实造模成功。空白组、模型组豚鼠每日给予等容积纯净水灌胃，每日灌胃3次。丹芪和血片组给予丹芪和血片2.33g/（kg.d），每天灌胃3次，每6小时1次。乌杞益白高剂量组、中剂量组、低剂量组分别按0.93g/（kg.d），0.46g/（kg.d），0.23g/（kg.d）的剂量灌胃，每日灌胃3次，每6小时1次。连续灌胃30d。给药期间，各组豚鼠每2d用脱毛膏在受试区脱毛1次，实验期间密切观察豚鼠皮肤颜色变化。
1.2.2 豚鼠血清TYR、α-MSH、MAO含量测定 各组豚鼠在首次给药前经豚鼠后肢静脉采血，转速3500r/min，时间15min离心后取血清，保存于-80℃冰箱中。从室温平衡60min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。设置标准品孔，空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50µL。样本孔中加待测样本50µL；
空白孔加样本稀释液50µL。空白孔，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（Peroxidase，HRP）标记的检测抗体100µL，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60min。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350µL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A、B各50µL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50µL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。测血清中酪氨酸酶（TYR）、α黑色素细胞刺激素（a-MSH）、单胺氧化酶（MAO）的含量；
末次给药结束后豚鼠心脏取血，同样方法测血清中酪氨酸酶（TYR）、α黑色素细胞刺激素（a-MSH）、单胺氧化酶（MAO）的含量。
1.3 观察指标
1.3.1 疗效 豚鼠受试区皮肤拍照记录色素脱失情况，进行疗效评估。疗效分为有效和无效。无效：受试区皮肤出现色岛及色素斑＜5%或无变化；
有效：受试区皮肤出现色岛及色素斑≥5%。
1.3.2 豚鼠受试区皮肤黑素毛囊数 各组豚鼠在受试区中心部位取1cm×1cm皮肤1块，经苏木精-伊红（HE）染色，进行组织学观察、毛囊计数，计算单位面积中有黑色素的毛囊数及所占比例。
1.4 统计学方法 用SPSS 25.0进行数据统计学分析，计量资料采用（x-±s）表示，多组比较用单因素ANOVA检验，两两组间比较用事后多重比较LSD法，治疗前后比较用配对t检验。计数资料采用（n，%）表示，组间比较用χ2检验（确切概率法）。以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 模型制作情况 空白对照组豚鼠涂抹蒸馏水30d后，未出现脱色。模型组，丹芪和血片组，乌杞益白胶囊高、中、低剂量治疗组用药部位在实验第10天开始陆续出现点滴状皮肤脱色（皮肤镜图1A），第28天造模豚鼠的造模部位皮肤均出现不同程度的脱色（皮肤镜图1B）。
图1 模型组脱色情况
2.2 疗效观察 乌杞益白胶囊高剂量组有效率为80%、中剂量组有效率为70%，低剂量组有效率为50%，丹芪和血片组有效率为50%，模型组有效率为0%，五组数据有统计学差异（χ2=16.228，P＜0.05）。乌杞益白胶囊高剂量组与中剂量组相比，无统计学差异（P＞0.05），乌杞益白胶囊高剂量组与低剂量组相比，无统计学差异（P＞0.05），乌杞益白胶囊高剂量组与丹芪和血片组相比，无统计学差异（P＞0.05）。见表1。
表1 乌杞益白胶囊对白癜风动物模型的疗效［n（%）］
2.3 乌杞益白胶囊对白癜风动物模型黑素的影响 乌杞益白胶囊组、丹芪和血片组表皮基底细胞与棘层黑素分布及有黑素毛囊数明显增加，与模型对照组比较均有显著性差异（P＜0.05）。结果见表2。
表2 乌杞益白胶囊对白癜风动物模型黑素的影响（±s）
表2 乌杞益白胶囊对白癜风动物模型黑素的影响（±s）
注：与模型组比较*P＜0.05
组别 黑素分布 黑素毛囊数空白对照组 ++++ 31.70±1.56模型对照组 ± 4.70±0.95丹芪和血片组 ++ 14.80±1.14*乌杞益白胶囊0.93g/（kg·d） +++ 26.70±1.50*乌杞益白胶囊0.46g/（kg·d） +++ 14.70±0.95*乌杞益白胶囊0.23g/（kg·d） ++ 10.70±0.95*P＜0.05
2.4 乌杞益白胶囊对白癜风豚鼠模型血清酪氨酸酶含量的影响 将治疗前的血清酪氨酸酶含量与治疗后的酪氨酸酶含量进行比较，差异有统计学意义（P＜O.05）。治疗后六组血清酪氨酸酶含量比较，差异均有统计学意义（P＜O.05），见表3。
表3 治疗前后对酪氨酸酶的影响（±s）
表3 治疗前后对酪氨酸酶的影响（±s）
组别 n 治疗前（µmol/L）治疗后（µmol/L） t P空白组 10 12.74±1.40 12.90±1.25 1.438 0.184模型组 10 7.79±1.15* 8.26±1.43 1.826 0.101乌杞益白胶囊0.93g/（kg·d） 10 7.30±0.89* 11.06±0.80# 14.577 ＜0.001乌杞益白胶囊0.46g/（kg·d） 10 7.76±0.38* 10.79±1.58# 6.357 ＜0.001乌杞益白胶囊0.23g/（kg·d） 10 6.88±1.36* 7.98±1.58 2.014 0.075丹芪和血片 10 8.65±1.09* 12.22±0.98# 13.081 ＜0.001 F 38.021 27.710 P＜0.001 ＜0.001
2.5 乌杞益白胶囊对白癜风豚鼠模型血清α黑色素细胞刺激素含量的影响 将治疗前的血清α黑色素细胞刺激素含量与治疗后的血清α黑色素细胞刺激素含量进行比较，差异有统计学意义（P＜0.05）见表4。六组α黑色素细胞刺激素含量比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。见表4。
表4 治疗前后对血清α黑色素细胞刺激素的影响（±s）
表4 治疗前后对血清α黑色素细胞刺激素的影响（±s）
注：*与空白组相比P＜0.05；
#与模型组相比P＜0.05
组别 n 治疗前（µmol/L） 治疗后（µmol/L） t P空白组 10 1.55±0.27 1.64±0.23 2.115 0.032模型组 10 1.21±0.13* 1.26±0.14 4.741 0.064乌杞益白胶囊0.93g/（kg·d） 10 1.17±0.10* 1.57±0.15# 8.451 ＜0.001乌杞益白胶囊0.46g/（kg·d） 10 1.11±0.66* 1.48±0.17# 9.287 ＜0.001乌杞益白胶囊0.23g/（kg·d） 10 1.04±0.37* 1.23±0.13 5.489 ＜0.001丹芪和血片 10 1.23±0.17* 1.60±0.18 12.557 ＜0.001 F 15.062 9.997 P＜0.001 ＜0.001
2.6 乌杞益白胶囊对白癜风豚鼠模型血清单胺氧化酶含量的影响 将治疗前的血清单胺氧化酶含量与治疗后的血清单胺氧化酶含量进行比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。6组血清单胺氧化酶含量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表5。
表5 治疗前后对单胺氧化酶的影响（±s）
表5 治疗前后对单胺氧化酶的影响（±s）
注：*与空白组相比P＜0.05；
#与模型组相比P＜0.05
组别 n 治疗前（ng/mL） 治疗后（ng/mL） t P空白组 10 44.78±2.76 44.98±2.71 0.493 0.692模型组 10 72.96±6.06* 71.93±6.76 0.409 0.634乌杞益白胶囊0.93g/（kg·d） 10 71.03±4.51* 53.19±5.53# 10.461 ＜0.001乌杞益白胶囊0.46g/（kg·d） 10 69.33±6.13* 57.13±4.09# 5.051 0.001乌杞益白胶囊0.23g/（kg·d） 10 73.75±7.11* 66.33±6.54 2.127 0.062丹芪和血片 10 67.10±4.02* 58.78±6.27# 7.017 ＜0.001 F 42.215 29.803 P＜0.001 ＜0.001
2.7 HE染色结果 空白组皮肤可见大量黑素颗粒；
模型对照组皮肤毛囊数量相对较少，毛干、毛根及毛球部可观察到少量的黑素颗粒；
丹芪和血片组皮肤只见少量的黑素颗粒；
乌杞益白胶囊高剂量组皮肤毛囊数量较低剂量组较多，可观察到毛根及毛球有较多的黑素颗粒；
乌杞益白胶囊中剂量组皮肤在真皮层可观察到少量黑素颗粒；
乌杞益白胶囊低剂量组毛囊数较少，可观察到少量的黑素颗粒；
见图2。
图2 HE染色结果（×200倍）
白癜风在中医学中又称为“白癜”“白驳风”。《医林改错》认为“白癜风，血瘀皮内”。皮肤为身体的藩篱，外邪首先侵犯皮肤，肺五色主白，合皮毛，肺卫受侵，皮肤则表现为白斑相应。现代医家提出肝肾不足、气血失和，病久气滞血瘀为白癜风主要病机［5］。肝五色主青，肾五色主黑，久病伤精耗血，肝血肾精受损，可现肤色减退和脱失，而发生白斑。肾为先天之本，肾藏精，肝藏血，肝肾同源，精血同源。肝肾不足可致皮肤失于濡养，出现白斑。刘巧教授［6］提出因为长期的工作导致肝肾阴虚，故成年人的白癜风治疗应当以滋补肝肾为法。朱仁康［7］教授提出“肝肾阴亏，肌表不荣，腠理失于濡养，进而发为白斑”的观点。乌杞益白胶囊有滋补肝肾、疏肝调气、肝肾精血充足、气血调和、脉络充盈、肌肤得养、白斑得消等功能，具备这些功效是白癜风治疗的重点。高如宏从事白癜风临床治疗多年，他提出从“皮毛生肾”论治白癜风，皮毛与肺、肾关系尤为密切。诚如 《素问·五胜生成篇》 中所裁：“肺之合皮也，其荣毛也。”《素问·阴阳应象大论》载：“西方生燥，燥生金，金生辛，辛生肺，肺生皮毛，皮毛生肾。”由此可见，皮毛不仅与肺密切相关，而且与肾相关紧盛。明·马莳《黄帝内经素问注证发微》载：“肾主水，金实生之，故皮毛生肾。”清·张隐庵谓：“皮毛生肾，肺气主于皮毛，因金气而生肾。”清·高士宗谓：“皮毛复而所生，故皮毛生肾。”《黄帝内经素问译释》裁：“皮毛润泽则又能生养于肾。”皮毛润泽需要气血滋养，肾为先天之本，肾藏精生血，肺主宣发肃降，肺将脾运输的气血精微布陈肌肤，肌肤得以滋养，皮肤润泽又能养于肾。肝肾同源，肾精充足，才能补养肝血。乌杞益白胶囊发明者高如宏认为白癜风的病位在肺肝肾，病机为气血失和，精血不足而致，乌杞益白胶囊由我院制剂室加工而成，通过多年的临床应用发现疗效稳定，主要用于白癜风稳定期辨证为肝肾不足的患者。
酪氨酸酶作为一种铜结合金属酶，可以催化酪氨酸生成多巴胺和多巴醌，所以在黑素合成中有着关键作用［8］，使黑素细胞产生黑色素，白癜风基本的病理变化就是黑素细胞减少或消失［9］。本实验结果也提示乌杞益白胶囊能明显增强酪氨酸酶的活性，可使白癜风模型豚鼠血清酪氨酸酶含量升高，这表明对于白癜风的皮损，乌杞益白胶囊有一定治疗作用。
血清α黑色素细胞刺激素也称为促黑激素，主要是刺激黑色素分泌，促使黑色素细胞树突形成和保护黑色素细胞。本实验结果也提示乌杞益白胶囊能显著增强血清α黑色素细胞刺激素的活性，可使白癜风模型豚鼠血清α黑色素细胞刺激素升高，促进皮肤黑色素的生成。
单胺氧化酶是一种含Cu2+的金属酶［10］，白癜风患者血清单胺氧化酶活性往往增强，进一步对黑素细胞造成损伤，实验研究则表明乌杞益白胶囊能下调血清单胺氧化酶的含量，减少对黑素细胞的损伤。
本实验研究表明不同剂量的乌杞益白胶囊对白癜风动物模型有较好治疗效果，使豚鼠血清酪氨酸酶、血清α黑色素细胞刺激素升高，单胺氧化酶降低，说明乌杞白胶囊能明显改善白癜风豚鼠的病变，为其临床广泛应用提供依据。对乌杞益白胶囊治疗白癜风作用机制的研究仍需深入，目前还只是研究了乌杞益白胶囊在酪氨酸酶和黑素合成中发挥的作用，可进一步研究乌杞益白胶囊对黑素细胞的其他促进作用。
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