彭修义，刘连娣，王 瑞，宋萧萧，崔武卫,2，殷军艺*
(1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；
2.加拿大农业及农业食品部圭尔夫研究与发展中心，安大略 圭尔夫 NIG5C9)
炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，以慢性腹泻、腹痛和直肠出血为特征[1]。近几十年来，全球IBD发病率和流行率不断升高，尤其是在西方国家最为普遍[2]。有关IBD发病机制，现有研究表明肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素12(IL-12)等促炎细胞因子与IL-4、IL-10等抗炎细胞因子的失衡，在调节IBD炎症中起到关键作用[3]。目前治疗IBD药物，如糖皮质激素、氨基水杨酸盐、免疫抑制剂和生物制剂等[4]，若长期服用会造成一定的副作用。因此，亟需寻找无毒副作用的天然活性物质作为替代。
豌豆(PisumsativumL.)又称雪豆、青豆等，属于豆科(Leguminosae)蝶形华亚科(Papilionoideae)豌豆属(Pisum)，是主要的食用豆类之一[5]。我国是全球第二大豌豆生产国，产量高达世界豌豆总产量的1/3[6]。豌豆营养丰富，其中淀粉(60%～65%)、蛋白质(21%～32%)和非淀粉多糖(～5%)的含量相对较高，脂质含量(～2%)很低，是优质植物性食物来源[7]。豌豆还可发挥维持胃肠道功能稳态[8]和控制血糖变化[9]等多种功能作用。Bibi等[10]研究了饮食中添加10%豌豆对于葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导结肠炎小鼠的保护作用，发现添加豌豆饮食可减少肠炎小鼠中性粒细胞的浸润和IL-6等炎症标志物分泌。豌豆蛋白[11]和豌豆多酚提取物[12]均可以降低结肠炎小鼠结肠组织损伤，阻止结肠缩短和疾病活动指数(Disease activity index，DAI)上升，保护肠道屏障功能。
近年来，越来越多研究表明植物多糖作为一种天然活性成分，对IBD具有积极的预防和保护作用[13,14]，但是鲜有针对豌豆多糖的报道。结构特征方面，Misaki等[7]将豌豆去皮后提取粗多糖进行分析，发现豌豆多糖属于果胶类多糖，均重分子量为488 kDa，其中阿拉伯糖的含量高达50%。功能活性方面，有研究发现[15]豌豆荚中提取得到的多糖，具有良好的抗氧化和抗菌性能。豌豆壳纤维的膳食添加也有促进肠道运动频率，增强肠道健康的作用[16]。
因此，本研究采用水提醇沉法制备豌豆粗多糖，利用JK008树脂对其进行纯化得到豌豆多糖(Pea Polysaccharides，PPs)，测定其基本结构特征，并构建DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎模型，探究豌豆多糖对小鼠基本生理状况、结肠组织病理学及炎症因子分泌等干预作用。本研究为结肠炎辅助治疗产品开发以及豌豆多糖高值化利用提供理论基础。
1.1 材料与试剂
豌豆(中豌六号)，河北省廊坊市；
C57BL/6小鼠(20±2 g)，SPF级，实验动物许可证号：SCXK(湘)2019-0004，5周龄，雄性，湖南斯莱克景达实验动物有限公司；
JK008树脂，安徽三星科技有限公司；
葡聚糖硫酸钠(DSS，MW36000～50000)，美国MP公司；
4%多聚甲醛溶液和BCA蛋白质测定试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司；
苏木精、伊红染料，武汉赛维尔生物有限公司；
IL-1β、IL-6、IL-10、IL-22 ELISA试剂盒，南京福麦斯生物技术有限公司；
无水乙醇、浓盐酸、氢氧化钠等其他化学试剂均为分析纯级别。
1.2 仪器与设备
E2695高效液相色谱仪，美国Waters公司；
Dionex ICS 6000离子交换色谱仪、Variouskan Flash全波长多功能酶标仪、高速冷冻离心机，美国赛默飞世尔科技公司；
FreeZone冷冻干燥机，美国Labconco公司；
23LV100病理切片扫描仪，德国徕卡生物系统有限公司；
DFY-1000C高速粉碎机，温岭市林大机械有限公司；
HH-4数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司。
2.1 豌豆多糖提取制备及基本理化性质测定
2.1.1 豌豆多糖的提取及纯化
参考Bai等方法[17]并略作修改提取豌豆粗多糖。具体步骤如下：高速粉碎机将豌豆打成豆粉，过60目筛，取适量过筛豆粉，加入10倍体积蒸馏水，95 ℃水浴条件下充分搅拌提取。提取结束后离心取上清液，依次加入适量的耐高温α-淀粉酶、木瓜蛋白酶和淀粉葡萄糖苷酶酶解，酶解结束后煮沸灭酶15 min。旋蒸浓缩上清液至原体积1/5，匀速加入4倍95%乙醇至浓缩液，室温静置过夜，8 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀。蒸馏水复溶后，旋蒸去掉多糖溶液有机相，冷冻干燥即得到豌豆粗多糖。
对豌豆粗多糖进行纯化。具体步骤如下：将冻干后的豌豆粗多糖复溶，配成10 mg·mL-1糖液，按照质量比1：20的比例加入活化好的JK008树脂，静态吸附8 h，10 000 r·min-1离心10 min后合并上清，旋蒸浓缩醇沉(4倍体积95%乙醇)，旋蒸除去有机后冻干，即得纯度较高的豌豆多糖。
2.1.2 基本组成测定
中性糖含量测定：采用苯酚-硫酸法[18]，吸取1 mL浓度为0.1 mg·mL-1样品，加入1 mL 3%的苯酚摇匀，缓慢加入浓硫酸4 mL，充分混匀(移液管移取硫酸，缓慢加入，边加入边摇晃)室温反应35 min后，于490 nm处测定吸光度。
糖醛酸含量测定：采用咔唑-硫酸法[19]，吸取1 mL浓度为0.1 mg·mL-1样品，冰浴中加入6 mL优级浓硫酸，边加边缓慢摇晃，于85 ℃水浴20 min，取出冷却至室温，加入0.2 mL 0.1%咔唑-乙醇，摇晃混匀，室温放置2 h，于530 nm处测定吸光度。
蛋白质含量测定：采用考马斯亮蓝法[20]，吸取1 mL浓度为0.1 mg·mL-1样品，加入考马斯溶液5 mL，盖塞翻转混合3～5次，室温条件下反应10 min，于595 nm处测定吸光度。
2.1.3 均一性和相对分子质量测定
采用高效凝胶渗透法进行分子量分布测定[21]。称取适量多糖样品，用0.02%的NaN3水溶液完全溶解配置成1 mg·mL-1的糖溶液，过0.22 μm水系滤膜后进样检测，以Dextran T-10、Dextran T-40、Dextran T-70、Dextran T-500、Dextran T-2000和Glc为标准品绘制标准曲线来计算样品的相对分子质量。
色谱条件：色谱柱为UltrahydrogelTMLinear Column(7.8 mm×300 mm)，流动相为0.02% NaN3溶液，流速0.6 mL·min-1，柱温40.0 ℃，样品浓度为1 mg·mL-1，进样量20 μL。
2.1.4 单糖组成测定
采用高效阴离子交换色谱-脉冲积分安培法(HPAEC-PAD)检测单糖组成[22]。称取5 mg多糖样品，于冰浴条件下加入0.5 mL 12 mol·L-1硫酸溶液，搅拌30 min后，加入2.5 mL去离子水稀释，然后转移至100 ℃油浴锅中并搅拌水解2 h。水解完全后进行充分冷却，将水解液定容至50 mL容量瓶并稀释5倍，过0.22 μm水系滤膜后进Dionex ICS 6000离子交换色谱系统进行检测。
色谱条件：色谱柱为CarboPacTMPA20保护柱和CarboPacTMPA20分析柱(4 mm×250 mm)，流动相为氢氧化钠、水和醋酸钠溶液，流速0.5 mL·min-1，柱温为30.0 ℃，进样量为10 μL。
2.2 动物实验设计
2.2.1 动物实验的分组及模型建立
42只C57BL/6J小鼠于饲养鼠笼中，室温25 ℃±2 ℃，相对湿度50±5%，并执行12 h/12 h的灯光/黑暗循环。静养7 d之后，随机将小鼠分为5组，分别为正常组、模型组、豌豆多糖低剂量组(L-PPs)、豌豆多糖中剂量组(M-PPs)和豌豆多糖高剂量组(H-PPs)，其中正常组10只小鼠，剩余4组每组8只小鼠。正常组和模型组每天经口灌胃0.2 mL生理盐水，实验组每天经口灌胃低(200 mg·kg-1)、中(400 mg·kg-1)、高(600 mg·kg-1)剂量的豌豆多糖溶液。灌胃7 d后，在第14天将模型组和实验组的饮水换成含3% DSS的灭菌水，正常组依旧给予正常灭菌水，造模7 d后，停止给予DSS无菌水，24 h后，将小鼠称重后进行脱颈处死，采集生物样本。动物实验设计流程如图1所示。
图1 动物实验设计流程Fig.1 Animal experiment design process
2.2.2 疾病活动指数(DAI)评分
在DSS造模期间，参考Jackson等人的方法[23]并稍作修改，每天上午称量小鼠的体重、观察粪便性状、记录小鼠腹泻、便血情况，进行DAI评分，DAI评分为体重下降、粪便性状和便血情况总得分的平均值，常用来表征小鼠结肠炎的严重程度。评分标准见表1。
表1 疾病活动指数评分标准Tab.1 Disease activity index scoring criteria
2.2.3 脾脏指数测定
取出并称量脾脏，计算脏器指数，脾脏指数=脾脏重量(mg)/体重(g)×100%。
2.2.4 结肠长度测定
量取升结肠至直肠长度为结肠长度，评价结肠长度变化。
2.2.5 结肠组织病理学观察
截取小鼠约1 cm长远端结肠组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定。石蜡包埋后，进行切片与苏木精伊红染色，进行病理组织学观察。按照Dieleman等人的评分标准[24]并稍作修改，对结肠组织病理情况进行评分，具体评分标准见表2。
表2 组织病理学评分标准Tab.2 Histopathological scoring criteria
2.2.6 结肠组织炎症因子测定
称取适量结肠样本，按照1：9(w/v)的比例加入预冷的PBS，研磨成匀浆后离心，收集上清液。按照对应的ELISA试剂盒操作说明，测定上清液中炎症因子IL-6，IL-1β，IL-10，IL-22的含量。另外，按照BCA蛋白浓度试剂盒的说明书检测上清液总蛋白含量，作为炎症因子含量的背景校正，单位为pg·mg-1。
2.3 数据处理
实验数据采用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析并绘图，各组数据均以均数±标准差(Mean±SD)表示，组间差异采用单因素方差分析(One-way-ANOVA)和Tukey检验。*P<0.05表示与模型相比有显著性差异，**P<0.01、***P<0.001表示与模型组相比有极显著性差异。
3.1 豌豆多糖的基本理化性质
表3为豌豆多糖的基本组成测定结果。可以看出，豌豆经水提醇沉提取、JK008树脂吸附纯化之后，其中性糖含量和糖醛酸含量分别为55.3%和29.8%，总糖含量达到85.1%，纯度较高。
表3 豌豆多糖的基本组成测定(平均值±标准偏差，n=3)Tab.3 Determination of the basic composition of pea polysaccharides(mean±SD,n=3)
图2是采用高效凝胶渗透法测定豌豆多糖的分子量结果，豌豆多糖相对分子量分布较宽且不均一，有四个洗脱峰，依据保留时间的不同，表明豌豆多糖由4.68×103，610，144和2.8 kDa 4个组分构成且以610 kDa分子量为主。与Wu等人[25]测定豌豆多糖分子量主要为110和25 kDa的结果不一致，这可能是采用的多糖纯化方式不同导致的，Wu采用Sevag法脱蛋白的方式纯化多糖，而本研究则是采用JK008树脂吸附的方式，因此结果上存在一定差异。Sevag法脱除多糖中蛋白是实验室常用的方法，但是存在操作繁琐、成本较高和环境不友好的缺点，而JK008树脂作为一种大孔吸附树脂，有着良好的大孔网状结构和比表面积，具有操作简单，纯化高效和安全无毒的优点[26-27]。本研究使用JK008树脂对豌豆粗多糖进行纯化，可以有效脱除豌豆粗多糖中的蛋白质和色素，提高中性糖和糖醛酸含量。
t/min图2 豌豆多糖的高效凝胶色谱图Fig.2 High-efficiency gel chromatogram of pea polysaccharides
豌豆多糖是主要由Rha、Ara、Gal、Glc、Xyl、Man和GalA组成(表4)，以Ara(20.1%)、Gal(15.1%)和GalA(13.1%)为主，属于果胶类多糖，与Zhang等[28]报道的结果相似。
表4 豌豆多糖的单糖组成分析(平均值±标准偏差，n=3)Tab.4 Monosaccharide composition analysis of pea polysaccharides(mean±SD,n=3)
3.2 豌豆多糖对DSS诱导结肠炎小鼠的干预保护作用
3.2.1 对小鼠体重和DAI评分的影响
DAI值常被用来表征结肠炎小鼠患病程度，结肠炎造模期间小鼠的体重及DAI值变化率如图3所示。正常组小鼠的体重保持稳定且略有上升，模型组和给药组小鼠在第4天后体重均呈现了不同程度的下降，其中M-PPs和H-PPs相比于模型组体重下降趋势相对较慢(图3A)。图3B显示，正常组的DAI值基本为零，而其他组别DAI值则随着造模时间的推移而逐渐增大，在第7天，模型组DAI值达到最大，而豌豆多糖组的DAI值相比于模型组则更低，其中M-PPs的DAI得分相较于L-PPs和H-PPs更低。上述结果说明，DSS诱导的小鼠急性溃疡性结肠炎模型成功，而豌豆多糖干预延缓了结肠炎小鼠的体重下降，改善了结肠炎小鼠DAI评分，减轻了DSS诱导的结肠炎患病程度。
t/d
3.2.2 对小鼠脾脏指数的影响
脾脏是重要的免疫器官，随着炎症的发生和加重，脾脏会出现肿大[3]。豌豆多糖对小鼠脾脏指数的影响如图4所示。
图4 豌豆多糖对小鼠脾脏指数的影响(图上方为各组脾脏代表性图片)。(n=5～6)Fig.4 Effect of pea polysaccharides on spleen index in mice (representative pictures of spleens in each group above).(n=5～6)
可以发现，模型组(6.24±0.29%)的脾脏指数相较于正常组(4.01±0.07%)显著升高(P<0.001)，说明模型组的脾脏肿大程度高，炎症严重。在豌豆多糖的干预下，脾脏肿大情况得到缓解，其中M-PPs组的脾脏指数(4.69±0.22%)相较于模型组极显著的降低(P<0.001)，如实物图所示，脾脏肿大明显改善，炎症缓解。
3.2.3 对小鼠结肠长度和结肠组织病理的影响
豌豆多糖对小鼠结肠长度和结肠组织病理的影响见图5。DSS诱导小鼠结肠炎模型中，随着炎症严重程度的增加结肠会缩短[29]，从图5A和图5B可以明显看出，模型组的结肠与正常组相比显著缩短，而M-PPs和H-PPs组结肠长度相较于模型组有增长的趋势，但是差异不显著。
结肠的肠绒毛、隐窝、腺体的结构完整性以及杯状细胞的结构和数量，可以在一定程度上反映结肠的健康程度[30]。为了评估豌豆多糖对结肠组织的影响，对小鼠结肠组织进行了病理学切片分析(图5C)及组织学评分(图5D)。从图可以看出，正常组小鼠结肠组织形态完整。模型组结肠组织的隐窝发生萎缩甚至消失，杯状细胞数量减少，中性粒细胞大量浸润，黏膜下层发生水肿，与肌层的紧密连接受损，组织学评分相比于正常组极显著升高(P<0.001)。相比与模型组而言，豌豆多糖组结肠组织的结构则更加完整，杯状细胞数量增多，损伤更少。此外，与L-PPs和H-PPs组相比，M-PPs组隐窝结构更加完好，隐窝没有发生上移，结肠黏膜下层水肿更轻，与肌层结合更紧密。M-PPs组的组织学评分与模型组之间存在显著性差异(P<0.05)，表明M-PPs组的小鼠结肠损伤的情况得到很好改善，结肠组织结构的完整性得到有效保护。
图5 豌豆多糖对小鼠结肠长度和结肠组织病理的影响。(n=6～8)(A)结肠形貌观察；
(B)小鼠结肠长度；
(C)各组代表性的HE染色组织切片；
(D)组织病理学评分。注：(a):杯状细胞；
(b):隐窝(c):黏膜下层(d):肌层(e):中性粒细胞。
3.2.4 对小鼠结肠组织促炎和抗炎细胞因子的影响
炎症细胞因子的水平对于评判炎症的轻重程度具有重要作用，促炎细胞因子和抗炎细胞因子的平衡对于炎症的调控有着重要影响[31]。豌豆多糖对小鼠结肠组织炎症细胞因子表达水平的影响如图6所示。与正常组相比，模型组小鼠结肠组织促炎细胞因子IL-1β、IL-6含量升高，其中IL-1β的含量极显著升高(P<0.001)，抗炎细胞因子IL-10和IL-22的含量则极显著降低(P<0.001)。在豌豆多糖干预下，结肠炎小鼠促炎细胞因子IL-6、IL-1β水平降低，IL-10和IL-22水平提高。与L-PPs和H-PPs组相比，M-PPs组肠炎小鼠结肠组织IL-22的分泌水平(364.36±15.87) pg·mg-1相较于模型组极显著升高(P<0.001)，和正常组的水平相当。
图6 豌豆多糖对小鼠结肠组织炎症细胞因子水平的影响。(n=5～6)(A)IL-6水平；
(B)IL-1β水平；
(C)IL-10水平；
(D)IL-22水平。
3.3 讨论
DSS诱导的急性结肠炎模型是一种常用的、简单且易于操作的结肠炎模型，与人类UC的病理特征相似，临床表现为体重下降、腹泻便血，发生炎症反应，组织病理学表现为杯状细胞减少、隐窝结构破坏以及中性粒细胞浸润[32]。在本研究中，模型组小鼠相较于正常组出现了体重明显下降、稀便和便血情况严重、脾脏肿大、结肠缩短等症状，在结肠病理组织学上表现出隐窝结构异常且隐窝上移，杯状细胞数量减少，中性粒细胞大量浸润，发生隐窝炎等结肠组织病变。而在豌豆多糖干预下，结肠炎小鼠的一般症状得到一定缓解，结肠组织结构完整性提高。此外，相较于与L-PPs和H-PPs组，M-PPs组显示出更好的缓解作用，其脾脏指数极显著降低，结肠长度更长，组织学评分也更低。
近年来，很多研究者指出果胶类多糖作为一种肠道微生物群可及的碳水化合物，对结肠炎症具有改善作用。Pan等人[33]从中药菝葜的根茎中提取果胶多糖，揭示了其对肠道黏膜侵蚀和炎症细胞浸润的缓解作用。本研究提取制备的豌豆多糖是一种果胶类多糖，阿拉伯糖的含量较高，而阿拉伯糖在DSS诱导的结肠炎中可以发挥抗炎作用[34]。Zhang等人[35]从牛蒡中提取纯化多糖，其阿拉伯糖的含量超过50%，能够在体内外抑制促炎细胞因子IL-6、IL-1β的产生，增加抗炎细胞因子IL-10含量。这表明豌豆多糖表现出对结肠炎小鼠抗炎作用的原因之一可能是其阿拉伯糖的含量较高。
炎症细胞因子作为免疫反应中不可或缺的组成部分，可以向众多的免疫细胞发送信号，对细胞免疫调节至关重要[36]。过量的促炎细胞因子如IL-6、IL-1β等，可引发与免疫反应相关的疾病，而抗炎细胞因子如IL-10等可改善炎症反应[37]。在豌豆多糖的干预下，结肠炎小鼠IL-6、IL-1β水平降低，IL-10的水平相对提高。此外，豌豆多糖的干预使结肠炎小鼠结肠组织IL-22的分泌水平均显著提高，其中M-PPs组和正常组的水平相当。有研究指出[38]IL-22可促进杯状细胞分泌粘蛋白，形成稳定的肠道屏障，隔离上皮细胞和微生物之间的直接相互作用，促进结肠损伤的恢复。因此，抗炎细胞因子IL-22水平的调控，可能是豌豆多糖发挥对结肠炎小鼠保护作用的重要因素之一。
综上所述，豌豆多糖干预可以发挥对结肠炎小鼠的保护作用，这可能与保护结肠组织结构完整，增强肠道屏障功能以及调控结肠组织促炎细胞因子和抗炎细胞因子分泌水平的平衡有关。此外，相较于与L-PPs和H-PPs组，M-PPs组对于结肠炎的保护效果更佳，一方面L-PPs组的干预效果不佳可能是剂量不足导致的，另一方面H-PPs组的干预剂量过高，则可能会致使肠道部分有害菌的增加，扰乱肠道微生物的平衡[39]，进而降低保护效果。这说明灌胃多糖的干预剂量也并非越大越好，要寻找一个最佳干预剂量。
本研究提取纯化得到的豌豆多糖是一种阿拉伯糖含量较高的果胶类多糖，能够改善肠道完整性和肠道屏障功能，抑制促炎细胞因子的表达，提高抗炎细胞因子水平，减轻DSS诱导的小鼠结肠炎，具有治疗或辅助治疗结肠炎的潜力，未来可进一步针对豌豆多糖干预剂量及其与结肠炎治疗药物复配对其功能提质性和副作用进行探究。本研究为结肠炎辅助治疗产品开发以及豌豆多糖高值化利用提供理论基础。
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