王 平 杨 军 王向东 张 罗,3*
(1.首都医科大学附属北京同仁医院耳鼻咽喉头颈外科，北京 100730；
2.北京市耳鼻咽喉科研究所，北京 100005；
3.中国医学科学院慢性鼻病诊疗策略研究创新单元，北京 100005)
慢性鼻窦炎(chronic rhinosinusitis，CRS)是耳鼻咽喉科一种常见、复杂且易复发的慢性鼻黏膜炎症性疾病，主要的症状有鼻塞、流涕、头面部疼痛、嗅觉丧失或嗅觉受损等[1]。我国CRS的患病率约为2%～8%，对患者和社会均造成较大的经济负担[2]。研究[3-4]显示，CRS的发病机制呈高度异质性及显著的地域性差别。目前大多数关于CRS的研究集中在以白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)、IL-5、IL-13等细胞因子为代表的Th2型免疫细胞介导的炎症反应，和以干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)为代表的Th1型和IL-17为代表的Th17型免疫细胞介导的炎症反应[5]。且有研究[6]显示，Th2失调的炎症环境下，CRS中的巨噬细胞功能受影响。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)即内毒素，作为革兰阴性厌氧菌细胞壁外膜中的脂多糖成分，是一类代表性的免疫应激诱导剂，可以诱导不同类型的细胞产生各种细胞因子。而人单核细胞THP-1是LPS在体内的主要效应细胞，LPS通过刺激人单核细胞THP-1产生多种炎症因子，如IL-1β、IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等，参与机体的免疫调控机制。
黄芩苷(baicalin)是从植物黄芩(Scutellariabaicalensis)根部分离提取出的一种黄酮类化合物，已有研究[7-13]证实黄芩苷具有抗病毒、抗细菌、抗氧化等作用，在多种疾病中有潜在的药用价值，如心血管疾病、肿瘤、纤维化和神经中枢系统疾病等。本研究旨在观察黄芩苷对LPS诱导的人单核细胞THP-1的炎症反应的作用，为将黄芩苷应用于炎症反应相关的疾病的预防和治疗提供理论依据。
1.1 主要试剂和仪器
人外周血单核细胞系THP-1购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心(北京协和细胞资源中心)；
RPMI1640培养基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国Hyclone公司；
LPS(EscherichiacoliO11:B4)、细胞培养用双抗和Trizol购自美国Sigma公司；
黄芩苷购自山东诸城市浩天药业有限公司；
乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自中国碧云天生物技术有限公司；
cDNA反转录试剂购自日本Takara公司；
SYBR Green荧光定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction，qPCR)试剂购自中国武汉Abclonal公司；
引物合成于天津擎科生物技术有限公司(引物详细信息如表1所示)。
表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences
BB15型CO2细胞培养箱、ST-16R、Sorvall Legeng Micro 17R 型低温高速离心机、1374生物安全柜均购自美国Thermo公司；
Nanodrop 2000购自美国Thermo公司；
Epoch2型酶标仪购自BioTek公司；
倒置显微镜购自日本Niko公司，ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司。
1.2 THP-1细胞培养
THP-1细胞在含有10%(体积分数)FBS和1%(质量分数)双抗的RPMI-1640培养基中培养[(37 ℃)、5%(体积分数) CO2]，细胞生长至90%时，将细胞转移至15 mL离心管中，室温1 000 r/min离心5 min，弃去上清，用1 mL完全培养基吹打均匀，调整THP-1细胞浓度至4×106个/mL均匀接种至12孔板中用于后续实验，或者继续在10 cm培养皿中传代培养。
1.3 细胞毒性检测
THP-1细胞以4×106个/mL的密度均匀接种至12孔板中。分别加入终浓度为0、10、30、100、300、1 000 μmol/L的黄芩苷，每个浓度设3个平行孔。置37 ℃、5%(体积分数) CO2培养箱中培养24、48 h后，阳性对照孔提前1 h加入用PBS稀释乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放试剂(PBS与LDH释放试剂体积比为9∶1)。随后将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5 min。分别取上清液120 μL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。各孔分别加入60 μL LDH检测工作液；
混匀，室温避光置于水平摇床孵育30 min；
然后在490 nm处测定吸光度。使用630 nm波长作为参考波长进行双波长测定。细胞毒性或死亡率%=(处理样品吸光度-样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度-样品对照孔吸光度)×100。每组3个复孔，实验重复3次 。
1.4 RNA提取
THP-1细胞经过室温1 000 r/min离心5 min，加入Trizol后，先置于冰上，室温放置5 min，使其充分裂解(此时可以放入-80 ℃长期保存)；
4 ℃，12 000 r/min 离心5 min，弃沉淀；
加入0.2倍体积的氯仿，充分混匀后室温放置10 min；
4 ℃，12 000 r/min离心15 min；
吸取上层水相至新的EP管中，按0.6倍水相体积加入异丙醇，室温静置5 min；
4 ℃，12 000 r/min离心10 min，弃上清，RNA沉于管底；
加入1 mL 75%(体积分数)乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；
4 ℃，12 000 r/min离心5 min，尽量弃上清；
室温晾干。
根据沉淀的量用DEPC处理过的H2O 溶解RNA样品，用Nanodrop 2000测定RNA的浓度和纯度(用Trizol提取的RNAA260/A280值在1.9～2.0之间)。
1.5 cDNA反转录
测量总RNA的浓度，并统一将浓度调为200 ng/μL；
反转体系：5×反转录试剂混合物4 μL, 总RNA 10 μL, 无RNase ddH2O 6 μL，轻柔混匀后进行反转录反应，条件如下: 37 ℃15 min(反转录反应)，85 ℃ 5 s(反转录酶的失活反应)，4 ℃短期保存。
1.6 实时荧光qPCR(real-time qPCR ,RT-qPCR)检测
在每个反应体系中加入的组分如下：2×SYBR Green Mix 5 μL, 10 μmol/L 引物各0.5 μL, cDNA 1 μL, ddH2O 3 μL，将反应体系加入到384孔板中，并平整地贴好封膜，1 500 r/min离心2 min；
将384孔板按照仪器的说明放入到反应托架上，并设置如下的反应程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，设置2～4程序循环反应40次，溶解曲线反应程序，冷却反应。反应结束后，设置好样品顺序和检测的基因等信息，使用系统软件分析数据，系统程序将根据目的基因和内参基因的Ct值自动计算出该检测基因的基因相对表达量；
基因相对表达量的算法为：基因相对表达量值=2-(Ct目的基因-Ct内参基因)。
1.7 统计学方法
2.1 LPS诱导的人单核细胞THP-1炎症反应模型构建
对照细胞组和不同浓度的LPS(0.1、0.3、1、3、10 μg/mL)刺激人单核细胞THP-1后24 h，提取细胞RNA，将RNA反转录成cDNA后，RT-qPCR法检测IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α的相对表达。结果如图1所示，所有浓度的LPS均可显著促进人单核细胞THP-1的IL-1β、IL-8和TNF-α的表达增加，LPS各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。LPS浓度大于0.3 μg/mL时，可显著促进人单核细胞THP-1的IL-6的表达增加，而LPS浓度大于1 μg/mL时，可显著促进人单核细胞THP-1的GM-CSF的表达增加(P<0.05)。因此，后续实验选择1 μg/mL的LPS为最佳刺激浓度。
2.2 黄芩苷对人单核细胞THP-1的毒性影响
对照细胞组和使用不同浓度的黄芩苷(10、30、100、300、1 000 μmol/L)分别处理人单核细胞THP-1 24 h和48 h，取细胞上清液使用LDH毒性检测试剂盒检测黄芩苷的细胞毒性，将对照组(未加黄芩苷)的细胞毒性定义为1，若相对细胞毒性>1，且与对照比相比差异有统计学意义(P<0.05)，则说明此浓度下的黄芩苷对细胞有明显的毒害作用。结果如图2所示，10、30、100、300、1 000 μmol/L的黄芩苷在预处理人单核细胞THP-1 24 h后，均未对细胞活力产生明显的毒性作用，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。但300 μmol/L和1 000 μmol/L的黄芩苷处理人单核细胞THP-1 48 h后，有明显的细胞毒性作用，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。因此，后续实验选择使用10、30、100 μmol/L的黄芩苷去验证其抗炎作用。
图2 对照组和不同浓度的黄芩苷处理人单核细胞THP-1 24 h和48 h后的相对细胞毒性Fig.2 Relative effect of control and different concentrations of baicalin on the toxicity of human monocytes THP-1 after 24 h and 48 h treatment
2.3 黄芩苷可抑制LPS诱导的人单核细胞THP-1的炎症因子的表达
为了验证黄芩苷对LPS诱导的人单核细胞THP-1的炎症反应的影响，单独使用不同浓度的黄芩苷(10、30、100 μmol/L)对细胞预处理24 h，此外加入不同浓度的黄芩苷的同时加入1 μg/mL的LPS共处理细胞24 h。结果显示单独加入10、30、100 μmol/L的黄芩苷不会引起人单核细胞THP-1的炎症反应，与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。黄芩苷可有效抑制LPS诱导的人单核细胞THP-1的炎症反应，10 μmol/L的黄芩苷可有效抑制LPS诱导的人单核细胞THP-1的IL-8的表达增加，30 μmol/L 和100 μmol/L的黄芩苷可有效抑制LPS诱导的人单核细胞THP-1的IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α的表达增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图3。
图3 对照细胞组和不同浓度的黄芩苷单独或与1 μg/mL LPS共同处理人单核细胞THP-1 24 h后IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α的相对表达Fig.3 Relative expression of IL-1β , IL-6 , IL-8 , GM-CSF and TNF-α in the control cells and after 24 h treatment of human monocytes with different concentrations of baicalin alone or together with 1 μg/mL LPS
近年来，黄芩苷因其具有良好的抗炎作用，越来越广泛地被应用于炎性相关疾病的细胞模型和动物模型的治疗中。有研究[14-15]显示黄芩提取物在卵清蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的小鼠哮喘模型中，可显著降低血清中总IgE和OVA特异性IgE浓度，降低Th2细胞因子IL-1β、IL-4、IL-5和TNF-α的升高浓度等，起到良好的抗炎效果。并且黄芩苷可以在OVA诱导的过敏性鼻炎小鼠模型中，减少鼻腔灌洗液和鼻黏膜上皮细胞中多种炎症细胞的浸润程度，改善鼻黏膜厚度和黏液分泌状况[16]。利用非靶向代谢组学技术解析以上机制，发现黄芩苷可能通过调节OVA诱导的小鼠的代谢紊乱起到抗炎作用[17]。此外，有研究[18-19]还显示黄芩苷可影响叉头框蛋白P3(forkhead box protein P3, FOXP3)、信号转导与转录激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)或通过抑制核转录因子-κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)的表达来调控下游细胞因子的表达。本研究中黄芩苷的抗炎作用机制可能是通过抑制人单核细胞THP-1的NF-κB的表达来调控下游IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α等炎症因子的转录水平的表达，本课题组会在后续的研究中对此进行验证。
本研究中以人单核细胞THP-1为细胞模型，LPS诱导导致人单核细胞THP-1多种细胞因子释放增加，如IL-1β、IL-6、IL-8、GM-CSF和TNF-α。使用不同浓度的黄芩苷预处理，观察黄芩苷对LPS诱导的人单核细胞THP-1的炎症反应的影响。本研究中对黄芩苷使用浓度范围的选择根据其对细胞毒性的影响，实验结果显示300 μmol/L和1 000 μmol/L的黄芩苷处理细胞48 h后，与对照组相比有显著的细胞毒性作用(P<0.05)，所以后续的功能研究选择10、30和100 μmol/L的黄芩苷。此外根据研究结果显示，10 μmol/L的黄芩苷除显著抑制IL-8的表达外，对其他细胞因子表达的抑制差异均无统计学意义，因此笔者未对浓度低于10 μmol/L的黄芩苷的抗炎作用进行深入的研究。本研究显示，黄芩苷对炎症的抑制效果呈剂量依赖。本研究仍存在一定的局限性，本课题组将在后续黄芩苷的抗炎机制研究中增加细胞因子的蛋白水平变化的检测和对巨噬细胞功能的研究，并深入解析黄芩苷潜在的抗炎机制。研究成果为后续黄芩苷应用于炎症相关疾病的临床治疗提供良好的理论依据。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献声明王平：提出研究思路，进行全部实验验证和数据分析，撰写论文；
杨军：重复部分实验验证；
王向东：对研究思路和数据分析进行把关；
张罗：总体把关，审定论文。